北京博蕾德生物科技有限公司

化工仪器网高级12

收藏

可溶性凋亡基因sCD95(APO1/Fas) ELISA 试剂盒

时间:2013-06-17      阅读:1339

sCD95(APO1/Fas) ELISA 试剂盒
 
用途:
人sCD95 ELISA 试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的可溶性
CD95(APO-1, Fas)。本实验可以检测天然的和重组的sCD95。本试剂盒于研究,而非
用于诊断。
试验原理:
sCD95 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。抗sCD95 特异单克隆抗体包被
微孔板,已知sCD95 浓度的标准样本、对照样本和未知样本加入微孔进行检测。
先将sCD95 抗原和生物素标记的抗sCD95 特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后,加入亲和
素过氧化物酶。再经过孵育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入酶复合物的作用底物,产生
颜色反应。颜色的深浅和样本中sCD95 的浓度呈比例关系。
提供的试剂和配制方法:
 

试剂(2~8℃保存)
数量
色标
配制
96 微孔板
1
 
即用型
塑料盖板
2
 
 
标准品:3000pg/ml
2 支冻干粉
黄色
按标签要求以标准稀释液稀释
对照
2 支
银色
按标签要求以标准稀释液稀释
标准稀释缓冲液
1 支(25ml)
黑色
10X, 用蒸馏水稀释
生物素标记抗sCD95
1 支(0.4ml)
红色
用生物素标记抗体稀释液稀释
生物素标记抗体稀释液
1 支(13ml)
红色
即用型
亲和素HRP
2 支(5ul)
 
0.5mlHRP 稀释液预稀释
HRP 稀释液
1 支(23ml)
红色
即用型
洗涤液
1 支(10ml)
白色
200X, 用蒸馏水稀释
TMB
1 支(24ml)
 
即用型
硫酸终止液
1 支(11ml)
黑色
即用型

 
试验需要但未提供的用品:
􀁺 蒸馏水
􀁺 微量加样器:10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
􀁺 旋涡振荡器和磁力搅拌器
安全性:
􀁺 仅用于科研
􀁺 本试验所用的人血成分均经检测,不含有HbsAg 和抗HIV 阳性物质。尽管如此,无法
确保没有传播肝炎或艾滋病等的可能。因此处理这些血清、血浆样本时,应该遵守
有关的安全操作规程,例如CDC/NIH 健康手册:“微生物学和生物医学试验中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 与皮肤接触。如有接触,可用水*冲洗。
→ 不可在使用试剂盒的地方吃饭、饮水、吸烟或化妆。
→ 不可用口吸取样本。
操作要点/试验室质量控制:
1、 使用前应根据标签上指示冷藏。使用时所有试剂应平衡至室温。冻干标准品使用后
应丢弃。
2、 取出所需的孔条后,立即密封包装,以防变质。
3、 不用时所有试剂要加盖封好。
4、 不同批号的试剂不可混用。
5、 过期的试剂不可再用。
6、 使用干净的吸头来吸取各种试剂、标准品、对照或样本,以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液时,避免使用带金属部分的加样器。
7、 用干净的塑料容器配备洗涤液。
8、 使用前用振荡器*混匀各种试剂。
9、 微孔内残留液须充分吸干或在吸水纸上拍干,吸水纸不可插入孔内吸水。
10、 TMB溶液是光敏的,避免长时光照。避免与金属接触产生颜色反应。
警告:TMB 有毒,避免手直接接触,并妥当处理。
11、 如配制后几分钟产生深兰色,表明TMB 溶液被污染,必须弃去。在检测完成
后一小时内必须读结果。
12、 吸取样本时,按顺序逐孔加样,以确保孵育时间相同。
13、 孵育时间见操作规程。
14、 在洗涤微孔板之后15 分钟内加入TMB 溶液。
 
样品收集,处理和保存
1、 细胞培养上清液——1000xg 离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
2、 血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液
后,1000xg 离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
3、 血浆——EDTA,柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg 离心30 分钟去除颗粒。
4、 保存——如果样品不直接使用,将其分为小部分(250-500ul)-70℃下保存,避免
反复冷冻。如果可能,不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒,检测前
先离心或过滤。
注意:不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂准备:
1、标准稀释缓冲液
蒸馏水10 倍稀释。
2、标准品
按标签要求以标准稀释液配制,其浓度为3000pg/ml sCD95,可储存。稀释前轻轻
振荡此标准品5 分钟。每次实验前将此标准品进行系列稀释,不能保存。
3、对照
按标签要求以标准稀释液配制。加样前轻轻振荡对照5 分钟。稀释后不能储存。
4、生物素标记抗sCD95 的稀释
生物素标记抗sCD95 用生物素标记抗体稀释液根据使用微孔数在干净玻璃管中
稀释。试验时准备。参见下表:
 

使用微孔数
生物素标记的抗体(ul)
生物素标记抗体稀释液(ul)
16
40
1060
24
60
1590
32
80
2120
48
120
3180
96
240
6360

 
5、 亲和素HRP 的稀释
在含5ul 亲和素HRP 的瓶内加入0.5ml HRP 稀释液。本液为一次性使用。
根据使用微孔数在干净玻璃管中进一步稀释。参见下表:
 

使用微孔数
亲和素HRP(ul)
HRP 稀释液(ml)
16
30
2
24
45
3
32
60
4
48
75
5
96
150
10

 
6、 洗涤缓冲液的稀释
蒸馏水200 倍稀释。
检测方法:
1、 试剂用前充分混匀,避免产生泡沫。
2、 确定需要的微孔数,所有样本、标准品、空白和对照样本均要做双份。
3、 加100ul 配好的标准稀释液至标准孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。(配制见前
述)吸取200ul 标准品加入A1,A2。(见下表)从A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔内;
反复吸排,使之混合。重复此步骤,从B1,B2 至C1,C2,然后从C1,C2 至D1,D2 等等。
sCD95 标准稀释液浓度由3000 至93.75pg/ml。从zui后的F1,F2 孔内吸取100ul 弃掉。
4、 加100ul 配好的标准稀释液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 样本至样本孔和100ul 对照品至对照孔H1,H2。
6、 配制生物素标记的抗sCD95。(配制见前述)
7、 加50ul 生物素标记的抗sCD95 稀释液于所有孔内。
8、 盖上微孔板,室温下(18 至25℃)孵育1 小时。
9、 洗涤微孔板:① 吸去孔内液
② 加0.3ml 洗涤液于各孔
③ 再吸去各孔内液
④ 重复②和③二次
10、 仅在用前配制HRP 液。(配制见前述)
11、 加100ulHRP 液于各孔,含空白孔。加盖。
12、 室温下孵育0.5 小时。
13、 洗涤微孔板。(见步骤9)
14、 加100ulTMB 底物液至各孔。室温下避光孵育20 至30 分钟。
15、 通常根据ELISA 阅读器确定孵育时间:许多ELISA 阅读器仅读数至2.0 O.D 值。
监察O.D 值,应在阳性结果衰褪前终止反应。(不超过20 分钟)
16、 酶底物反应用100ul 硫酸加入各孔内终止。终止反应后1 小时内(这段时间在2
至8℃避光保存)或加入硫酸后立即读取结果。
17、 用分光光度仪读数,450nm 作为初始波长,620nm(可以用610 至650nm)作为
参考波长。
建议微孔板编码:
 

 
标准浓度(pg/ml)
样本孔
 
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
3000
3000
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B
1500
1500
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C
750
750
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
D
375
375
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E
187.5
187.5
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
F
93.75
93.75
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
G
空白
空白
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
H
对照
对照
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
结果分析:
制作一条标准曲线,平均光吸收值作Y 轴,对应的sCD95 浓度作X 轴。各样本中的sCD95
含量可根据样本O.D 值通过标准曲线来确定。
本试验的局限性:
超过标准曲线范围(3000pg/ml)时,不可推测结果;样本必须稀释后再检测。
本试验的检测特性:
1、 敏感性:zui小检测浓度低于47pg/ml。
2、 准确性:
 

批内
批间
样本
N
均值(pg/ml)
SD
CV%
样本
N
均值(pg/ml)
SD
CV %
A
14
1719
106
6.1
A
8
1752
145
8.2
B
16
703
39
5.5
B
8
856
68
7.9

 
检测程序小结: 总时间 = 1 小时45 分钟
加100ul 样本或配好的标准品或对照
 
加50ul 配好的生物素标记的抗体于各孔内
 
室温孵育1 小时
洗3 次
 
加100ul 亲和素-HRP 标记物
 
室温孵育0.5 小时
洗3 次
加100ul TMB,避光,显色20 至30 分钟
 
加100ul 硫酸,终止反应
 
在450nm 处读取吸光度
 
北京博蕾德生物科技有限公司提供
注意: 请以原文说明书为准
 
上一篇: 细胞目录 下一篇: 碱性成纤维生长因子(bFGF)的药理作用和临床应用
提示

请选择您要拨打的电话: