产品描述

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用FITC或PE标记了的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外，试剂盒中还提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）和7AAD用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI和7AAD为核酸染料，不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI或7AAD联合使用时，PI和7AAD 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI- or 7AAD-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI- or 7AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI或PE 和7AAD 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+ or 7AAD+）。

产品组分

·         运输与保存方法

·             冰袋（wet ice）运输。本试剂盒中所有组分均在4℃保存，Annexin V-FITC、PI需避光保存。长期不用可将Annexin V-FITC放到-20 ºC保存。

·         使用说明

·         1.1 细胞样品制备

·           1.a) 悬浮细胞：在进行完细胞凋亡刺激后，1000g，4℃离心5 min收集细胞。
b) 贴壁细胞：把细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞），PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶（不含EDTA）消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使细胞发生吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度。加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g，4℃离心5 min。
注意：1）中期凋亡细胞因失去贴壁能力而悬浮于上清中，此部分细胞对于结果是否显著具有重大影响，不可任意丢弃，需离心收集后一起检测才能全面反映出细胞凋亡的整体情况；
2）胰酶消化时细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。

·           2.弃上清，用预冷的1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于10⁵），1000g，4℃离心5 min。收集细胞。
注意：PBS洗掉残留的胰酶，否则残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，zui终导致染色失败。

·           3.加入400μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。

·           4.加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。

·           5.加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 min。

·           6.在30分钟内进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

·         1.2 样品分析

·         A．流式细胞仪分析：

·         FITC的绿色荧光激发波长为488 nm，建议在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FL1为横坐标，FL2为纵坐标。每个样采集10000 events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

·         使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加，不同仪器之间的补偿不同。因此需要设置未处理的空白细胞和经Annexin V-FITC、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。

·         B．荧光显微镜分析：

·         1000g，4℃离心5 min，收集细胞，用50-100μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后，在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

·         注意事项

·           1.该试剂盒只能检测活细胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检测。

·           2.由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后尽快检测。

·           3.如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。

·           4.PBS洗涤细胞，洗掉残留的胰酶，否则残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，zui终导致染色失败。

·           5.荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

·           6.如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

·           7.试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

·           8.Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。

·           9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。