药典液相色谱方法的调整

根据药典附录“液相色谱法”规定，可调整适当参数
    ---调整目的：满足系统适用性的要求
    ---系统适用性的要求
    ---HPLC方法调整的考虑因素
05版药典的系统适用性要求
     1、理论塔板数：
           ----反映整个色谱系统的状态
                      填料状态
                      管线连接
                ----有不同的计算方法
                     主要是峰宽取值方法不同
                     不同计算方法计算结果有差异
                ----影响因素：
                     被测组分的保留时间、进样量等
                     积分参数
                     系统死体积
                     测定色谱方法、样品与计算方法保持恒定，以便比较
                     
05版药典的系统适用性要求
     2、分离度：
           ---影响因素：
                     *    影响柱效的因素
                           色谱柱尺寸
                           填料性能
                           进样量
                     *    影响分离选择性的因素
                           流动相组成
                           色谱柱品牌
                           柱温
                      *   柱外体积
                  ---有不同的计算方法，结果有差异
05版药典的系统适用性要求
  3、重复性（进样精密度）：
            *   外标法：对照品溶液（n：5）
                       峰面积RSD：2.0%
                 *    内标法：相当于80%，100%，120%的对照品溶液，加入规定量内标
                                       溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子（n：6）
                       校正因子RSD：2.0%
                 *    手动进样器：定量环（满环进样：进样体积至少为3倍定量环体积）
                       自动进样器：准确定量范围
05版药典的系统适用性要求
  4、拖尾因子：
            ----影响因素：
                  *    与理论塔板数相关的因素：
                         色谱柱选择、流动相、进样量、积分参数等
                  *     与检测品种与方法相关
                  *      峰高法定量分析：0.95~1.05
                     

HPLC方法参数调整
用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。
     如达不到要求，可对色谱分离条件做适当的调整。
不得改变：固定相种类，流动相组成，检测器种类。
可改变：色谱柱尺寸，牌号，填料粒度，流动相流速，流动相各组成的比例，梯度洗脱时间长度，柱温，进样量，检测器灵敏度等
常见的液相色谱参数的调整：其他参数
柱温：升高柱温有利于改变峰形和分离度，但要注意柱的zui高耐受力
进样量：在满足检测要求的前提下，尽量减少进样量
供试品溶剂：溶剂强度应等同或低于流动相洗脱强度
反相色谱中溶解样品的溶剂：
     *    甲醇并不是良溶剂
     *    推荐溶剂
           是流动相
           梯度为起始流动相
           尽可能有水溶液参与
           如果不得不用有机溶剂溶解，尽可能使用小进样量或两步稀释 
常见的液相色谱参数的调整：流动相
改变溶剂比例：根据色谱柱类型与状态
添加剂
     扫尾剂：有机胺
     缓冲溶液：10-50mM；从20mM开始，越少越好
     离子对试剂：平衡时间长，易在色谱柱中保留
缓冲液pH
     酸含量
     缓冲液的缓冲容量：pKa+-1
     对方法耐用性的影响
常见的液相色谱参数的调整：固定相
关注不同品牌色谱柱的选择性差异
      碱性化合物：封端柱、内嵌极性基团柱
      pH耐受范围
      耐受高水相柱：阿莫西林含量及有关物质的测定
关注色谱柱规格对分离的影响
     长度：
     内径：可决定流速
     粒度：越小，柱效越高
     孔径：与样品分子量大小相关

药品杂质分析：杂质定义
任何影响药品纯度的物质
在药品质量标准中的杂质系指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定的原辅料生产的药品中，由其生产工艺和原辅料带入的杂质，或经稳定性试验确证的在贮存过程中产生的降解产物。
药品质量标准中的杂质不包括：
     *    变更生产工艺或原辅料而产生的新的杂质：重新申报
     *    掺入或污染的外来物：假劣药品，非法定方法予以检测
液相色谱法进行有关物质检查
仪器要求：
      检测灵敏度
      检测手段-专属性
      数据处理：积分参数（zui小峰高和zui小峰面积设定）
已知杂质：采用对照品或相对保留时间定位
专属性：采用DAD确定UV紫外光谱或不同波长的响应情况
定量：已知杂质杂质：测定对主成分的相对响应因子
                 未知杂质：主成分自身对照法
杂质确定
可用DAD、MSD确定杂质峰的数目
用空白试验排除干扰
     *    空白溶剂进样（考虑进样溶剂的影响）
     *     运行空白梯度（考虑流动相溶剂质量的影响）
降低系统残留的影响
     *    手动进样阀的清洗
     *     自动进样器应采用洗针进样模式
考虑色谱分离方法的影响
      *     分离度、进样量
影响检测器灵敏度的因素
检测器
     *    流通池：体积大，灵敏度高
     *     紫外灯能量
     *     采样频率：大于15Hz时可准确描述峰
死体积
     *    仪器连接管线应尽量减小柱外体积，避免色谱峰的扩散
     *     运行空白梯度（考虑流动相溶剂质量的影响）
上样量
流动相：在低波长检测时，影响大