地高辛 DIG 应用小帖士

DNA 的标记和检测（Southern Blotting）
     如果用以探针合成的DNA 的模板的数量比较少或是质量不够高的时候，建议您使用PCR DIG Probe Synthe
sis Kit。该试剂盒是于制备高灵敏度的杂交探针，例如单拷贝的基因。其另一个特点就是无需定量斑点检测
过程，通过定量凝胶电泳就可以快速确定PCR 标记探针的效率。
     如果您手上有足够量的高纯度模板，建议您选用随机引物标记方法的DIG High Prime DNA Labeling and D
etection Starter Kits I 和II。这两个试剂盒包含了标记，封闭，杂交和检测所需要的所有试剂，是真正意义上的
一站式服务的试剂盒，提供您DIG 标记和检测实验需要的所有产品。它们之间的差别在于检测方法的不同：Sta
rter Kits I 采用了显色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II 选用化学发光法底物CSPD。
RNA 的标记和检测（Northern Blotting）
     在Northern blotting 中即可以使用DNA 探针，也可以使用RNA 探针。通常，RNA 探针的特异性和灵敏度度
都会更高一些；当然如果对灵敏度和特异性没有特别严格的要求的话，DNA 探针会更方便操作。
     如果您需要制备RNA 探针的话，推荐您使用Northern Starter Kit。该试剂盒以线性的DNA 为模板，通过SP
6, T7 或是T3 RNA 聚合酶的作用将DIG-11-UTP 掺入到转录的RNA 中，借助化学发光底物CDP-Star 检测。另
一个产品DIG RNA Labeling Kit 也可用于RNA 探针的标记。
标记探针的定量
      尽管DIG 系统的灵敏度很高，为了获得理想的实验结果，标记探针和模板的用量是很重要的。同样在每次标
记实验后，通过spot test 检测探针的标记效率也是非常重要的，可用以准确计算杂交实验中的探针用量。杂交实
验中探针用量的不准带来的影响是显而易见的：探针的用量太多会带来太多的背景问题，而探针的用量过少，则
又会导致杂交信号太弱。DIG 系统的优势就在于：DIG PCR 探针的产量可以通过凝胶电泳的方式来定量。RNA
探针则可以检测到探针的完整性。
杂交温度
      杂交条件的优化取决于杂交片段的类型以及GC 含量。RNA-RNA 和RNA-DNA 间的杂交温度就要比DNADNA
间的高。总体来说，不同片段间的杂交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做为一个通常的规
律，以40％GC 含量的哺乳动物目的片段为例，在DIG Easy Hyb (DIG 系统，无毒，不含DNase、RN
ase 和任何的污染物) 或是50％甲酰胺存在环境下的杂交温度分别是：

DNA-DNA: 37-42℃
DNA-RNA: 50℃
RNA-RNA: 68℃

靶核酸的胶上样量
      由于DIG 系统的高灵敏度的特点，靶核酸的胶上样量要小于其他的系统（Table 2）。同时DIG 系统匹配的
阳离子的尼龙膜也为DIG 标记的杂交检测实验提供了zui强的信号和zui低的背景影响。
检测方法
       对于探针和靶序列间形成的杂交子的检测通常使用碱性磷酸酶耦联的抗体，采用显色或化学发光法检测（ta
ble 3）。在众多的碱性磷酸酶的底物中，我们推荐使用CDP-Star 或CSPD 用于化学发光检测，NBT/BCIP 用于
显色反应。此外对于膜杂交中的化学发光信号的检测，建议使用Lumi-Film 以获得的信号。
探针的拨离和重探
      每一个探针的杂交信号都很强，基本上没有什么背景信号。在探针的拨离过程中没有明显的靶RNA 的丢失。使
用探针拨离和重探技术，单一的一样张膜上可进行多达14 次的检测分析。

检测底物
   即用型CDP-Star
      碱性磷酸酶作用于CDP-Star 底物，产生的光信号被X 胶片曝光或是图像设备采集。与CSPD
相比较，CDP-Star 的主要特点在于由于光信号产生的速度更快（10 倍于CSPD）同时强度更强，可大量缩短曝
光时间。其信号的释放可以持续大概两天的时间，因此可以进行多次曝光。化学发光的底物仅仅适用于尼龙膜。
   即用型CSPD
      碱性磷酸酶作用于CSPD 底物，产生的光信号可被X 胶片（例如：Lumi-Film）或是图像设备采集。由于其同样
具有持续的发光过程，因此也可以进行多次曝光。在尼龙膜上使用CSPD 或CDP-Star 底物的杂交，还可进行探
针的拨离和重探。
  NBT/BCIP
      使用类似NBT/BCIP 显色底物的好处就在于，检测的过程中不在需要X 胶片，既可以使用尼龙膜也可以是使用
硝化纤维素膜。然而，如果想要获得高灵敏度的检测结果，可能就需要较长的时间了（几个小时）。这种方法也
有其不足之处：首先通过这种方法只能一次性获得信号，不能多次检测；在探针拨离前，需要使用二甲基甲酰胺
先将膜上沉淀的颜色去除。
   其他的底物和抗体
      在整个DIG 系统中，还有其他的一些底物和多种荧光抗体，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPP
Fluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate；供不同研究的需要。