用于病毒复制研究的正置荧光显微镜
冠状病毒2致重度急性呼吸综合征(SARS-CoV-2)出现于2019年末，并快速传播全球。由于其大面积的影响，研究人员对病毒的性质进行了深入的研究以期最终阻止大流行。一个重要的方面是病毒如何在宿主细胞中复制。Ogando及其同事的研究已经揭示了SARS-CoV-2的复制动力学、适应能力和细胞病理学。他们的工具之一是用荧光显微镜观察SARS-CoV-2感染的VeroE6细胞。通过使用前一段时间产生的抗SARS-CoV（2002）的抗体，他们发现了与SARS-CoV-2的强烈交叉反应。因此，他们建立了一种通过免疫荧光显微成像研究SARS-CoV-2复制的工具。

   
用于病毒观察的显微镜
病毒可以借助几种显微镜技术进行研究。根据显微镜的放大倍数和分辨率，可以在组织水平、细胞水平或病毒粒子水平进行观察（图1）。通常，病毒粒子本身只能通过电子显微镜或超分辨显微镜来分辨。在细胞水平上，病毒大多借助先进的宽场荧光或共焦显微镜进行观察。在组织中，明场显微镜或基本的宽场荧光显微镜足以用于病毒研究。但是显微技术的鉴别并不是严格的。

光学数字图像处理工具如ICC光学图像解析等可以帮助提高背景信号比，减少离焦模糊。相关的对比度增强可以揭示显微图像中的附加信息。



图1: 病毒可从组织到单个病毒颗粒的不同层面进行观察。对于这种方法，需要明显的放大倍数和分辨率。因此，研究人员选择了一种适合他们需要的显微镜技术。

病毒蛋白的免疫荧光检查
在测序技术、生物信息学和电子显微镜中，Ogando等人通过荧光显微镜分析了感染细胞：VeroE6细胞生长在玻璃盖玻片上，感染SARS-CoV-2，并用多聚甲醛固定。然后，用事先暴露于SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育细胞（图2）。用荧光标示的二级抗体检测与veroe6细胞SARS-CoV-2结构结合的SARS-CoV源性抗体。此外，细胞核用Hoechst染色。用DM6 B直立荧光显微镜进行荧光成像。



图2: Ogando等人的一项实验涉及使用免疫荧光显微镜对VeroE6细胞成像。在2002/2003年SARS爆发期间，他们大体上探索了在兔子身上制备抗SARS-CoV抗血清的潜力。他们使用不同的兔抗血清作为第一组抗体。然后，用第二组荧光抗体标记这些兔抗血清。随后，用DM6 B显微镜进行荧光显微镜检查。
SARS-CoV抗血清与SARS-CoV-2的交叉反应

免疫荧光显微镜显示，许多SARS-CoV抗血清在SAR-SCoV-2感染细胞（病毒蛋白nsp3、nsp4、nsp5、nsp8、nsp9、nsp13、nsp15、N、M）中具有交叉反应性。这一事实意味着，针对SARS-CoV产生的抗血清也导致SARS-CoV-2感染细胞的特征性荧光染色（图3）。nsps出现在感染细胞的核周区，而N蛋白则分布在胞浆中。在高尔基体中检测到M蛋白。



图3: SARS-CoV-2感染VeroE6细胞后用兔SARS-CoV抗血清处理的免疫荧光显微镜。Nsps位于细胞核附近，M蛋白位于高尔基体。抗dsRNA抗体用于标记病毒RNA合成的复制中间产物。细胞核用Hoechst染色。（a）和（b）的比例尺为25 μm；（c）、（d）和（e）的比例尺为100 μm。图片来源：Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。

正置荧光显微镜在病毒学研究中的潜力
Ogando等人的研究中描述的交叉反应抗血清将是特征性SARS-CoV-2复制周期的实用工具。这个工具反过来能使研究人员能够确定复制抑制剂的潜在目标。

一个相对简单的实验装置-免疫荧光显微镜-足以得出病毒复制周期的结论。因为这种方法细胞生长在盖玻片上，并安装在玻片上，所以正置荧光显微镜是一种实用的解决方案。配备有电动载物台和采用宽视野（FOV）的自动化扫片模块帮助用户快速获取全玻片的图像概览。如果单视野快拍就能满足需求，则机械式载物台是更合理的选择。

阅读原版刊物
冠状病毒SARS-Cov-2在Vero E6细胞中复制：复制动力学、快速自适应性和细胞病理学
NS Ogando, TJ Dalebout, JC Zevenhoven-Dobbe, RWAL Limpens, Y van der Meer, L Clay, J
Druce, JJC de Vries, M Kikkert, M Bárcena, I Sidorov, EJ Snijder
Microbiology Society, 22 June 2020; doi.org/10.1099/jgv.0.001453

了解更多：徕卡显微