2021年10月27日，来自全国各地的Leica STED用户齐聚上海，参加了2021年徕卡STED club显微成像技术交流会。

开幕式上，徕卡显微系统中国区总经理陈淮先生对各位专家的莅临表示了欢迎，回顾了Leica在超高分辨成像领域多年的耕耘，并表示Leica会坚持和客户共同成长，为客户们提供更好的产品和服务。

会上诸多Leica的资深用户分享了自己的研究成果与心得体会，我们一起来回顾下吧。
讲题一：超分辨成像技术研究进展
讲者：深圳大学 屈军乐 教授

本次徕卡STED用户会学术交流环节的开场报告由深圳大学物理与光电工程学院的屈军乐教授带来，报告题目为“超分辨成像技术研究进展”。屈教授长期从事超分辨荧光显微技术及其生物医学应用研究并在该领域造诣颇深。本次报告中，屈教授不仅向我们介绍了他所带领的研究团队一路走来所发展的STED技术（包括自适应光学STED、相图分析STED、数字增强STED、时空调制STED、频率调制STED等）及其应用，还和我们分享了他们团队荧光染料开发的成果及宝贵经验。将STED的成像技术提升和新型荧光染料“双剑合璧”后，屈教授的团队实现了STED空间分辨率提升、长时间活细胞成像、低损耗光功率成像等多项技术突破。屈教授坦言，他在99年刚到深圳大学时就接触到徕卡SP2共聚焦，至今使用过多款徕卡显微成像设备，并对徕卡显微镜的成像质量和硬件品质给予了很高的评价。
讲题二：受激辐射显微镜在多种生物样品中的应用
讲者：上海科技大学 李晓明 主任

李晓明老师作为上海科技大学生命学院分子影像平台主任，自2016年平台成立以来，针对实验室不同研究需求采购了多个厂家的超高分辨率显微镜，其中就包括徕卡STED纳米显微成像设备。此次会议中李老师针对STED成像优势、成像过程中遇到的问题、解决方法及实际应用展开了详细介绍。
李老师首先就几台超高显微镜的特点，包括分辨率、灵敏度、特殊制样、所见即所得等多方面进行对比。STED纳米显微镜在分辨率方面可突破50nm，并做到所见即所得，但由于STED技术特点，获得高分辨率的同时会受到一些限制，比如需要特殊制样，样品不易太厚，成像深度不够，样品本身需要一定的荧光亮度和信噪比，并且由于较强的STED损耗光无法进行长时间活细胞成像等。随后李老师针对这些问题给出了一些解决或优化方法，在样品制备时，李老师推荐参考徕卡STED样品制备手册The_Guide_to_STED_Sample_Preparation_MC-0002370_25032021.pdf ，其中会标注注意事项及推荐的染料信息，值得一看。总结几点：优先选择775脉冲激光器；选择受激辐射效果好、信号亮、荧光稳定的染料；选择合适封片剂和标准盖玻片可减少折射率的影响，提高成像深度。在拍摄多通道时，注意拍摄顺序，当不同通道出现位置色差时可用STED标尺校正。超高显微镜的共定位分析不再简单的看两个通道是否重合，而是通过测两个蛋白间的距离来判断相关性。并且结合荧光寿命的新一代TauSTED的出现使得对厚样品不同层、活细胞不同时间的连续成像成为了可能。

讲题三：FLIM-FRET及STED技术联合使用在呼吸道病毒科研中的应用
讲者：中国医学科学院医学生物学研究所 陈燕丽 助理研究员
陈老师在讲座中介绍到共聚焦显微镜在呼吸道病毒的研究中应用领域很多，包括病毒与宿主蛋白的相互作用，例如病毒感染细胞会发生线粒体应激，产生线粒体DNA释放，N蛋白与其他蛋白的离体和在体相互关系等。
陈老师所在课题组制备了EVD68病毒的单克隆抗体A6-1,,为了研究抗体和病毒颗粒的相互作用，利用了FLIM-FRET技术，测定了两个毒株（KM毒株，Fermon毒株）的六个病毒片段和抗体的相互作用。发现VP1-1与A6-1的相互作用FRET高，并且使用其他的研究手段确定了二者的结合位点。
还研究了流感病毒的单克隆抗体CR9114，这个抗体和高危的流感毒株H1N1及H7N9的亲和力不高。通过改造抗体的轻链和重链，并且测定了和H1N1及H7N9的FRET效率，证实通过改造提高了CR9114和H1N1和H7N9的结合效率。还使用STED超高分辨显微镜观察了纳米颗粒疫苗的超微结构。

最后，陈老师总结道，FLIM-FRET可以用于呼吸道病毒颗粒和其抗体之间结合力的筛选，也可以用于改造后的抗体亲和力鉴定，在呼吸道病毒研究方面有广泛的应用前景。
讲题四：Super-resolution microscopy in biomedical research: challenges and potentials
讲者：Christian Eggeling, Friedrich Schiller University Jena  

来自于德国耶拿大学的Eggeling教授在此次讲座中主要介绍了他们实验室在生物膜分子运动研究中STED-FCS的应用。分子扩散运动一般可用于分子结合力的研究，例如，荧光标记的小分子在和大分子结合后，由于质量变大，运动速率降低；另一个重要的应用在于在纳米尺度上研究细胞膜上的生物活性。而研究分子扩散运动的经典方法之一就是荧光相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）。FCS通过测定溶液中微区内发光粒子因布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而获得单个粒子的浓度、化学动力学等参数信息。细胞膜上的脂筏富含胆固醇和鞘磷脂，是一个高度异质化和活跃的微小区域（<200nm），正是由于这一特点，使得其上的分子运动很难被观察到。为了研究这一问题，Eggeling教授团队构建了两个荧光标记（Atto647N）的脂类分子，甘油磷脂（PE）和鞘磷脂(SM)，利用FCS来观察这两个分子在质膜上的运动方式。PE和SM在膜上聚集、运动方式不同，SM更加密集，以一个整体来运动，运动速率应该较慢；而PE则是以散落的形式，更自由、快速的运动。使用Confocal-FCS来观察这两者的运动差别，由于空间分辨率的不足，无法得出有效FCS数据来支持以上假设。Eggeling教授进而使用了可以提供更高空间分辨率的STED-FCS来进行观察。分析结果表明PE在膜上是自由扩散，而SM会时不时被有胆固醇参与的“陷阱”捕获而停止运动。线扫STED-FCS结果表明，SM被捕获（trapping）的时间大概持续几秒，且这种现象只有在空间分辨率高于80nm时才可观察到。STED-FCS研究分子运动的方法可用于研究在免疫反应中T细胞的激活过程里脂类分子的运动机制和HIV病毒侵染宿主细胞后的Budding过程中的所涉及的脂类分子。
报告结束后，各位参会代表还前往丹纳赫中国总部参观了生命科学平台的客户体验中心，了解了丹纳赫在生命科学领域的多种解决方案。

整场活动内容精彩纷呈，通过亲身感受，各位专家表现出对徕卡超高分辨率解决方案浓厚的兴趣。同时，对于由于疫情原因未能亲临现场的老师，本次活动也提供现场直播的环节。现在，直播内容已经整理完毕，除了部分未发表数据应讲者要求隐藏之外，其他内容均已可以在线回看。

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