氮素是植物重要的营养元素之一。传统的氮素分析方法需要对叶片进行烘干消解处理，不但费时费力，还要使用大量对环境有污染的化学药品，更重要的是难以对同一植株进行跟踪检测，在野外大田采样测量也非常不方便。为了更加便捷准确地进行植物/作物氮素营养状况评估，新型无损检测技术无疑是必需的。

近日，Journal of Experimental Botany在线发表浙江大学题为“Optimal temporal-spatial fluorescence techniques for phenotyping nitrogen status in oilseed rape (Brassica napus L.)”的研究论文。

浙江大学的研究人员使用了三种荧光技术——OJIP快速叶绿素荧光动力学技术、脉冲调制式叶绿素荧光成像技术和多光谱荧光成像技术获取了不同氮素处理下油菜不同生长时期以及不同叶位的荧光数据。通过对荧光信号数据的单因素方差分析和线性判别分析，阐明了不同氮素处理的油菜叶绿素荧光信号在不同生长时期的垂直分布状态，从而揭示氮素诊断叶位、时期与荧光信号获取技术。本研究首先在室内通过盆栽实验展开相关研究，后进行了田间实验的验证，进而确保了结果的准确性与可重复性。

图1. 左：典型样品的RGB成像；右：实验设计流程

 
叶片氮素与植物的光合能力和叶绿素含量密切相关。OJIP与脉冲调制式叶绿素荧光技术获得的相关参数直接反映植物的光合能力与电子传递链的生理变化。多光谱荧光技术测量的红色荧光RF和近红外荧光IrF则直接反映了叶绿素含量，之前的相关研究已经指出RF/IrF这一比率与叶绿素浓度成负相关。这就是使用这三种技术进行氮素检测的理论基础。

图2. 左：相关叶绿素荧光参数；右：多光谱荧光RF/IrF成像图

 
研究结果表明，在抽薹期，底层叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm（脉冲调制式叶绿素荧光技术）和PI_ABS（OJIP快速叶绿素荧光动力学技术）对油菜氮素状况较为敏感，而顶叶的RF/IrF（多光谱荧光成像技术）在苗期早期敏感。在保证结果准确率的前提下，相比其他两种技术，多光谱荧光成像技术有其*的优势。首先，多光谱荧光成像在叶片顶部的敏感度高且检测的时间也早；其次，相较于其他叶绿素荧光技术，多光谱荧光成像技术不需要暗适应，因此更适合用于田间冠层尺度的检测。综上，本研究推断出多光谱荧光成像技术在油菜氮素水平的田间早期诊断中拥有较高潜力。本研究可为氮素施肥管理决策和高产品种选育提供理论和技术支持。

    基于这三种技术，目前有可以进行成像测量和仅能进行点测量的两类仪器。而对于类似研究来说，成像仪器无疑是具有巨大优势的。本研究中脉冲调制式叶绿素荧光成像和多光谱荧光成像分析都是使用的FluorCam开放式多光谱成像系统。这一系统是目前上*份可同时进行脉冲调制式叶绿素荧光成像、多光谱荧光成像和NDVI归一化植被指数成像的仪器。而且其升级型号更可以增加OJIP快速叶绿素荧光成像功能。由于OJIP快速叶绿素荧光成像技术难度较大，FluorCam也是目前*份能进行这一成像分析的仪器。因为条件限制，本研究中OJIP测量则只能使用具备这一功能的手持式叶绿素荧光仪进行叶片单点测量。

图3. 左：FluorCam开放式多光谱成像系统；中：使用FluorCam系统进行的拟南芥OJIP快速叶绿素荧光成像分析；右：可同时进行OJIP与脉冲调制式叶绿素荧光测量的FluorPen手持式叶绿素荧光仪

 
浙江大学使用FluorCam系统已经发表了近10篇SCI文献。而在相关氮素营养研究中，Specim高光谱成像技术也是被广泛应用的。浙江大学之前就使用这一技术研究了胡椒总氮的空间分布。高光谱成像技术与荧光成像技术结合则可以进行更加全面的植物营养表型研究。

图4. 左：Specim IQ智能高光谱成像仪；中：PhenoPlot轻便型光谱成像技术方案；右：浙江大学使用Specim技术进行的胡椒总氮空间分布研究

 
参考文献：

• Sun D, et al. 2020. Optimal temporal–spatial fluorescence techniques for phenotyping nitrogen status in oilseed rape. Journal of Experimental Botany, doi:10.1093/jxb/eraa372
• Yu K Q, et al. 2014. Hyperspectral Imaging for Mapping of Total Nitrogen Spatial Distribution in Pepper Plant. PLoS ONE 9(12): e116205. doi:10.1371/journal.pone.0116205

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