冷冻断裂与冷冻蚀刻基础介绍
时间：2023-04-24 阅读：618
揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构
冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。
作者：Gisela Höflinger
图1：麦叶上的蚜虫
适合于电子显微镜的环境
电子显微镜的样品室通过抽真空处理降*低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。
生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。
要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是一种方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着小阻力线断裂样本。
电子显微镜的样品室通过抽真空处理降*低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。
生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。
要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是一种方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着小阻力线断裂样本。
图2：冷冻断裂
水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染
要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。
要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。
图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质
水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。
注意：良好的真空度会降低水分压。
例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。
执行冷冻蚀刻直到样本*无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。
注意：良好的真空度会降低水分压。
例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。
执行冷冻蚀刻直到样本*无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。
图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）
样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。
纯水的理论升华速度会降低，因为：
样本深处的水升华速度比表面的水更慢。
盐和大分子溶剂会降低升华速度。
生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。
通过冷冻断裂生成图像
冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。
对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。
蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会*导电，复型也不会粘在一起。
冷冻断裂酵母的单向投影
图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。
图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。
图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。
图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片
图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。
图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。
图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。
图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。
图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。
图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。