CHOgro® High Yield Expression系统,高效、稳步提升CHO细胞蛋白表达
时间:2023-10-20 阅读:369
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,已成为治疗用蛋白类生物制品生产的主要细胞类型。随着瞬时转染技术(transient transfection)的进步,搭配CHO细胞进行毫克至克级别蛋白的快速、高效生产,帮助推动药物研发阶段进程,允许更早的评估候选药物是否具备理想属性,从而投入更多资源生成稳定的克隆细胞系,用于后续药物的临床开发。
凭借20年在核酸递转领域的深耕细作,Mirus推出了用于CHO细胞蛋白/抗体生产的完整瞬转系统——CHOgro® High Yield Expression System。通过整合Mirus转染技术及优化的CHO培养基,相比于现有技术方案,可将蛋白表达量提升2-10倍。除此之外,该系统不含动物源性成分,致力于稳定的提高悬浮CHO细胞的蛋白质产量。本文首先就影响CHO细胞在蛋白表达实验中的关键影响因素进行讨论,包括转染试剂、培养基选择、增强子使用及培养温度优化;Mirus CHOgro® High Yield Expression System体系,综合考虑上述影响CHO蛋白表达的关键因素,并且将转染试剂、培养基及增强子进行优化、整合;最后,结合Mirus CHOgro® High Yield Expression System针对不同蛋白/抗体类型的表达产量、体系放大以及细胞类型适配性数据,充分证明了Mirus CHOgro® High Yield Expression System具备高产量、高稳定性、广泛的适配性以及操作灵活性等优势。
Mirus CHOgro® High Yield Expression System(产品货号:MIR 6270)中包括了以下组分:
产品名称 | 规格 | 单组分货号 |
TransIT-PRO® 转染试剂 | 1 x 1 mL | MIR 5740 |
CHOgro® Titer Enhancer | 1 x 20 mL | MIR 6220 |
CHOgro® Expression Medium | 2 x 1 L | MIR 6200 |
CHOgro® Complex Formation Solution | 1 x 100 mL | MIR 6210 |
Poloxamer 188, 10% | 1 x 100 mL | MIR 6230 |
L-glutamine, 200 mM | 1 x 100 mL | MIR 6240 |
CHO细胞蛋白表达关键影响因素之转染试剂
CHOgro® High Yield Expression System系统中关键组分TransIT-PRO®转染试剂,通过优化瞬时转染效率,可进一步提高目标蛋白/抗体产量。同样的,该转染试剂不含动物源成分,可以与悬浮CHO或者293细胞搭配使用,并且可以兼容不同种类的培养基,旨在提高生产蛋白/抗体产量及稳定性。
测试使用CHOgro® High Yield Expression System系统中TransIT-PRO®转染试剂(试剂:DNA比例为1:1),在CHO-S细胞瞬转表达GFP荧光蛋白。转染后48小时,分别使用流式细胞仪和荧光显微镜检测试剂转染效率和细胞活力。结果表明,单独使用TransIT-PRO®转染试剂,可达到高水平的转染效率(图1)。
图1. 单独使用Mirus CHOgro® High Yield Expression系统中的转染试剂(TransIT-PRO® 转染试剂),也有着高水平的转染效率。
CHO细胞蛋白表达实验关键影响因素之培养基
CHOgro® High Yield Expression System中的另一关键组分CHOgro® Expression Medium,也是提升CHO细胞蛋白/抗体表达量的重要因素。细胞的生长状态、是否结团、细胞密度等都是评估CHO细胞培养基的关键参数。
在细胞生长状态方面,转染FreeStyle™ CHO-S细胞后,分别在CHOgro® Expression Medium和其他品牌培养基中进行培养。转染后六天,用CHOgro® High Yield Expression System中的CHOgro® Expression Medium培养的细胞结团数量明显少于其他品牌培养基(图2)。
图2. 使用Mirus CHOgro® High Yield Expression System中的CHOgro® Expression Medium进行培养(左),细胞结块数量显著少于其他培养基培养的CHO-S细胞(右)。
同样的,使用相同细胞系(FreeStyle™ CHO-S)及细胞密度(0.5×106 cells/ml),平行比较Mirus CHOgro® Expression培养基及其他品牌培养基。实验结果显示,在Mirus CHOgro® Expression培养基中生长的细胞,有着更高的细胞密度,这也是提高CHO细胞蛋白/抗体产量的重要前提。并且,在更高的细胞密度条件下,仍保持较高的细胞活性(图3)。
图3. 使用CHOgro® Expression Medium培养,CHO细胞密度更高,并且保持着较高细胞活性。
CHO细胞蛋白表达实验关键影响因素之增强子
使Mirus研发团队针对不同应用或者细胞类型,开发出多种相适配增强子,例如针对CHO细胞蛋白/抗体生产的增强子CHOgro® Titer Enhancer,也是包含在CHOgro® High Yield Expression System中的一个关键组分。其作用机制并非直接增加细胞的转染效率,而是通过调节细胞内特定的信号通路来增加CHO细胞的蛋白表达滴度。平行实验分别对比了CHO细胞对Fc融合蛋白与IgG的表达量,结果表明,与单独使用TransIT-PRO® 转染试剂相比,加入CHOgro® Titer Enhancer后,CHO细胞Fc融合蛋白的产量有显著提升(图4)。此外,与PEI转染体系相比,使用CHOgro系统的转染试剂和增强子,CHO细胞IgG的表达量可提高约3倍(图5)。
图4. 加入CHOgro® Titer Enhancer后,CHO细胞Fc融合蛋白的产量有显著提升
图5. TransIT -PRO®转染试剂搭配CHOgro® Titer Enhancer,相较于PEI转染体系,CHO细胞IgG的表达量可提高约3倍
CHO细胞蛋白表达实验关键影响因素之培养温度
Mirus CHOgro® High Yield Expression System除了通过培养基、转染试剂以及增强子三者的优化结合,在实验流程上也可以进行优化,从而进一步提高蛋白产量。根据科研或者不同应用需求,Mirus CHOgro® High Yield Expression System有着多种灵活实验方案供选择:
方案一:Mirus CHOgro® High Yield Expression System实验方案中所推荐的标准流程,即在转染当天加入CHOgro® Titer Enhancer,并立刻将细胞培养温度从37℃转移至32℃,转染后7-8天内收获蛋白,细胞活性仍可保持70%以上;
方案二:在方案一的基础上通过添加补料来延长细胞培养时间,保证细胞更长时间维持较高的密度和活率,将蛋白收获时间延长至7-11天;
方案三:转染后的细胞仍维持在37℃条件下培养,不加入补料,并在最短时间(4-5天)收获蛋白;
方案四:转染后的细胞仍维持在37℃条件下培养,通过在转染后18-24小时添加补料维持细胞密度和活率,将蛋白收获时间延长至4-7天。(有关添加细胞培养补料以维持细胞活率的建议,请参阅完整版实验方案)(图6)。
图6. CHOgro® High Yield Expression System的多种细胞培养方案
基于以上四种实验方案,分别测试了在转染后32℃和37℃培养条件下,以及是否添加补料对CHO细胞IgG产量的影响。实验使用CHOgro® High Yield Expression System,加入转染复合物及CHOgro® Titer Enhancer后,立即将CHO细胞转移至32℃(左)或保持在37℃(右)。结果显示,转染后将细胞转移到32℃条件下培养,IgG产量更高且细胞存活时间更长(图7)。
图7. 转染后将细胞转移到32℃条件下培养,IgG产量更高且细胞存活时间更长
尽管Mirus CHOgro® High Yield Expression System从CHO细胞蛋白表达实验关键组分即转染试剂、培养基和增强子进行了优化整合,并提供了灵活的实验应用方案来提升CHO细胞的蛋白产量,那么在实际生产过程中,该系统针对不同类型蛋白/抗体的产量、体系放大以及细胞类型适配性如何呢?
Mirus CHOgro® High Yield Expression System针对不同类型蛋白/抗体的表达,有着更高产量
使用相同的细胞类型(FreeStyle™ CHO-S cells)和质粒骨架,分别表达六种不同的治疗性抗体,比较测试了Mirus CHOgro® High Yield Expression System和其他品牌表达系统。实验结果表明,在所有测试的六种抗体类型中,使用Mirus CHOgro® High Yield Expression System的CHO细胞表达的蛋白滴度更高,并且转染试剂用量更少,蛋白生产成本更低(图8)。
图8. 相比其他品牌CHO转染表达系统,Mirus CHOgro® High Yield Expression System有着更高的蛋白产量
CHOgro® High Yield Expression System生产规模的可扩展性
通过对6孔板(细胞培养体积2mL)至5L摇瓶(细胞培养体积2L)等不同培养体积进行转染,对CHOgro® High Yield Expression System生产规模的可扩展性进行评估,实验结果表明,从最小反应体系(6孔板)至最大反应体系(5L摇瓶),生产体系放大了1000倍,都有着近似的蛋白滴度,意味着CHOgro® High Yield Expression System可以整合到不同CHO细胞蛋白/抗体研究和生产工作流中(图9)。
图9. Mirus CHOgro® High Yield Expression System的生产体系扩大1000倍,依然保持着近似的蛋白产量。
CHOgro® High Yield Expression System不同CHO细胞适配性
选择两种常用于蛋白/抗体生产的CHO悬浮细胞CHO-S和ExpiCHOTM,评估CHOgro® High Yield Expression System对不同CHO细胞类型的适配性。实验结果表明,CHOgro® High Yield Expression System可适配多种CHO细胞类型,在不同CHO细胞中的蛋白表达也有着近似的产量(图10)。
图10. Mirus CHOgro® High Yield Expression System可适配不同CHO细胞类型
综合上述,通过上述Mirus CHOgro® High Yield Expression System的测评数据,表明了该系统具有以下特点及优势:
更高的蛋白产量:可将CHO细胞瞬转的蛋白表达量提升2-10倍
可稳定放大生产体系:将转染体系放大1000倍,其蛋白表达量依然保持稳定
适配不同类型CHO细胞:搭配不同类型CHO细胞也可得到近似蛋白产量
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Mirus产品年鉴
美国Mirus公司成立于1995年,是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司,同时也是该类试剂的主要供应商之一。其产品线涵盖化学转染试剂、电转染产品、病毒生产和转导产品,适用于基因功能研究、蛋白生产、病毒载体生产和动物模型构建等领域。
北京西美杰科技有限公司是Mirus中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务,Mirus热销转染产品常备现货。北京西美杰是 Mirus代理, Mirus中国代理, Mirus北京代理, Mirus总代理, Mirus上海代理,, Mirus西北代理, Mirus西南代理, Mirus东北代理, Mirus华北代理, Mirus华南代理, Mirus华中代理,负责 Mirus在中国的相关业务。