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Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

（一）　原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200～1000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

二）操作方法及注意事项
1.不同浓度（密度）Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀释到所需浓度。
Percoll浓度（％）　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20
　　比重g／ml　　　  1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
    3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
    4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
    5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
（三）分离纯化细胞举例
1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管（或塑料管）分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
    2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者），按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

（四）　人不同血细胞的漂浮密度
表　　　人不同血细胞的漂浮密度
──────────────┬──────────────────
　　　细　胞　　　漂浮密度　　　　│ 细　胞　　　　　　　漂浮密度
──────────────┼──────────────────
　　　红细胞　　1.09-1.11　　　 　│淋巴细胞　　　　　　　1.052-1.077
　　　粒细胞　　　　　　　　　　  │ B淋巴细胞　　　　　 1.062-1.075
　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　  │ T淋巴细胞　　　　　 1.065-1.077
　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　 │ 淋巴母细胞　　　　　1.065-1.077
　　　单核细胞　1.050-1.066　　　 │自然杀伤细胞　　　　　1.050-1.070
　　　血小板　　1.030-1.060　　　 │
　　　──────────────┴──────────────────

（五）问与答　
问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?
答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg 
Percoll浓度（％）  70     60      50      40      30       20 
比重g／ml      1.090  1.077    1.067   1.056   1.043    1.031