背景:

spectrumlabs提供低蛋白结合的生物技术级纤维素酯(CE) 透析膜管和Float-A-Lyzer® G2即用型透析装置，包括100-1,000,000道尔顿的9种截留分子量规格。膜截留分子量是指截留90%样品时的膜孔径大小，在蛋白纯化应用中，选择zui适截留分子量的透析膜是去除不需要的小分子污染物所必须的。

由于在脱盐、 pH值调整及缓冲液置换等应用中，离子物质通常小于膜孔径，且至少比大分子物质小1000倍，所以选择截留分子量在3.5 kD至100kD 之间的膜即可在1-2天内达到所需的分离效果。*需要考虑的是，所选的膜截留分子量应小于需要截留的大分子物质的分子量。

透析是对不稳定的蛋白、敏感的酶以及精细化合物进行温和分离的方法，以维持物质的活性、功能以及稳定的水相环境。但是，需要清除的小分子污染通常只比目标蛋白小10-100倍，所以并不是所有截留分子量规格的膜都可以达到相同的分离效果。因此，在纯化大分子物质的应用中，选择*的膜截留分子量尤为重要。

目的:

比较使用截留分子量分别为20kD、50kD和100kD的Float-A-Lyzer® G2 即用型透析装置（FAL-G2）透析24h后的相对分离效果，实验处理目标为截留抗体（IgG，166kD），并清除不需要的小分子物质：分子量比抗体小100倍的维他命B12（Vit B12，1.35kD）以及分子量比抗体小10倍的细胞色素C（Cyt C，12.4kD）。

其次，为透析应用建立通用的*截留分子量确定方法，如蛋白纯化。

方法:

1. 3种不同分子量溶液制备如下：目标蛋白（IgG-166kD：1 mg/ml 0.9% PBS），1/10分子量污染物（细胞色素C-12.4kD：0.2 mg/ml 0.9%PBS）和1/100分子量污染物（维他命B12-1.35kD：0.2mg/ml 0.9% PBS）。

2. 9个FAL-G2（5ml容量规格）每个上样4ml溶液，具体设置如下：IgG分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Cyt C分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Vit B12分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管。

3. 9个FAL-G2均于室温下在独立的透析容器中透析24h，每个透析容器包括1L 的0.9% PBS缓冲液，并分别于3h和8h时置换新鲜缓冲液。

4. 在透析开始后0、3、8和24h，分别从每个 FAL-G2取出200μl 测试样品，用0.9% PBS以1:4 稀释，并用紫外可见分光光度计检测稀释后溶液浓度（IgG检测波长为280nm，Cyt C检测波长为406nm，Vit B12检测波长为366nm）。

5. 计算36个测试样品稀释前浓度，与透析前原始浓度比较（0h 测试样品），确定每种截留分子量FAL-G2（20kD、50kD和100kD）在3个时间点（3、8和24h）的溶质截留百分比。

结论 :

IgG纯化实验总体的截留分子量效率为：100kD > 50kD > 20kD；100kD 为IgG纯化的*截留分子量。

从不同截留分子量的截留曲线可以看到，50kD和100kD膜可在24h内有效清除维他命B12（1/100分子量污染物）；而20kD 截留分子量大约需要36h。只有100kD截留分子量可有效清除细胞色素C（1/10分子量污染物），*清除需要2-3天。20kD和50kD截留分子量不能有效清除细胞色素C。