动物外周血白细胞分离液实验方法
时间:2016-07-28 阅读:2957
“XXXX”动物外周血白细胞分离液实验方法
(细胞培养及分子生物学)
【产品规格】
200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用,试剂内容如下:
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| 名称 | 产品编号 |
| 规格 |
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| A | XXXX 动物外周血白细胞分离液 |
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| 200ml |
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| B | 样本稀释液(赠品) | 2010C1119 |
| 200ml |
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| C | 清洗液(赠品) |
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| 2010X1118 |
| 200ml |
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| D | 红细胞裂解液(赠品) | NH4CL2009 |
| 100ml |
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| E | 说明书 |
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| 1 份 |
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【实验前准备】 |
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A. 适用仪器 |
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| zui大离心力可达 1200g 的水平转子离心机 |
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B. 耗材 |
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| 产品名称 |
| 产品货号 |
| 产地 |
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| 15ml 离心管散装 |
| 339650 |
| 美国 NUNC |
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| 15ml 离心管架装 |
| 339651 |
| 美国 NUNC |
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| 50ml 离心管散装 |
| 339652 |
| 美国 NUNC |
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| 50ml 离心管架装 |
| 339653 |
| 美国 NUNC |
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无菌胶头滴管或塑料滴管
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
首先取抗凝血,根据样本量大小,分以下两种情况:
情况 A:血液样本量小于 5ml 时,实验方法如下:
1.取一支 15ml 离心管,先加入 5ml 分离液
2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液液面上,400-500g,离心 20-30min(注:如改变血液样本及分离液用量,需相应调整离心力及离心时间,具体离心条件需客户自行摸索,以达到*分离效果。)
3.离心后用吸管小心吸取所有环状乳白色细胞层(一层或两层),加入 10 ml 清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。250g,离心 10min。重复洗涤 2-3 次,即得所需白细胞。
4.如有红细胞残留请使用红细胞裂解液(产品编号:NH4CL2009)裂解红细胞,具体操作方法详见“红细胞裂解液使用说明”。
情况 B:血液样本量大于等于 5ml 时,实验方法如下:
1.取一支适当的离心管,先加入与样本等量的分离液。
2.将血液样本小心加于分离液之液面上,450-650g(zui大离心力可至 1000g),离心20-30min。(注:根据血液样本量确定离心条件,血液量越多,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件需客户自行摸索,以达到*分离效果。加入血液样本后,样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二)。
3.剩余步骤同“情况 A”中步骤 3 与步骤 4。
【注意事项】
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得*的实验结果,在取血 2h 内进行实验,血液存放时间越长,细胞分离效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验不要使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。
3.分离液用量大于稀释后血液样本时,分离效果更佳。
4.当血液样本粘度过高需稀释时,*稀释方法:将血液与样本稀释液(产品编号:2010C1119)1:1 稀释混匀备用。注:不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。如血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。
5.如实验后细胞得率或活性过低,请天津灏洋以寻求帮助,具体详见下方生产企业信息。
【储存条件及有效期】
18-25℃保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。
【参考值(参考范围)】
本实验白细胞提取率及纯度大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。
| 红细胞 |
| 白细胞 |
| 血小板 |
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| (4.0-10.0)×109 |
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含量(个/L) | (4.0-5.5)×1012 | 中性粒细胞 | 淋巴细胞 | 单核细胞 | (1.0-3.0)×1011 |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相关实验技术方案】
1.所获得白细胞的培养技术。
2.所获得白细胞的核酸提取技术。
3.所获得白细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.免疫组化技术C.原位杂交技术D.PCR 技术
【可能存在的问题及解决方法】
1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:
出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 |
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 |
离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | |
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离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 |
离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 | |
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2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心,其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时,恒定离心时间,对离心转速进行调整。
3.本分离液依照标准,全部使用药用级原料,性能指标与国产同类产品略有不同,可能出现红细胞沉降不*的情况,可以适当加大离心转速。
注:在对离心条件进行调整时,离心转速的加减以 50-100g 为基数,直至达到*分离效果,
离心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。