等度分离是指在洗脱过程中流动相组成不变的分离方法；而梯度分离是指在洗脱过程中流动相的组成随运行过程而变化的分离方法。梯度分离可以通过逐渐增加强溶剂的浓度，从而兼顾样品的分离度及保留时间。

目前，梯度条件应用得比等度少很多，主要原因有以下几点：

1.      一些实验室尚不具备梯度洗脱设备

2.      梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析

3.      某些检测器，如示差检测器不能使用梯度洗脱

4.      每次运行梯度洗脱后，需重新平衡色谱柱，耗时较长

5.      不同设备的分离效果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异

6.      梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂

1.      样品组分复杂，K值分布宽

2.      大分子样品，尤其是生物样品，如多肽的分离

3.      样品中含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续的运行中流出

梯度洗脱方法的影响因素比较多，所以当采用一种标准方法进行梯度试验的时候，会因为使用的系统的不同或色谱柱的不同，而使得目标峰的保留时间和分离效果有很大的差异

药典方法，作为一种法定的方法，流动相的组成不能随意变动。此时，实验者可以调整的只有色谱柱的品牌和梯度比例或速率。一部分实验者并不十分重视的色谱柱选择，对于梯度方法是更为重要的。即使同样的键合相，但生产厂家的不同或品牌的不同，其孔径、比表面积等填料参数均有很大差异，对样品的选择性也会有很大的差异。从经验来说，选择一只合适的色谱柱会更节约实验中的人力和物力的消耗。您可以根据分离需要，咨询色谱柱厂家，以获得更专业的色谱柱推荐。确定色谱柱之后，如果需要对分离度进行调整，首先应该从保留时间较短的一对色谱峰的分离度开始调整，然后一对一对依次进行调整。梯度方法和等度方法改善样品分离度的方法和思路是一致的。

1． 基线漂移

当采用梯度洗脱时，流动相的纯度不够易导致基线明显漂移。

2.  干扰峰

当进行空白梯度试验时，尤其用短波长UV检测和高灵敏度设置时，色谱图中可能会出现很大的谱峰。这类干扰峰可能由流动相中含有的疏水性的并具有UV吸收的杂质引起，如水、有机溶剂或流动相添加剂。出现这样的状况可通过简单的实验查出污染源。

查找污染源的*步是先用水相平衡柱30min，然后进行一次空白梯度。然后平衡5min后重复空白梯度。如*次运行的干扰峰大得多，可能是水污染。如两次空白运行无差异，有机溶剂的问题可能较大。流动相添加剂的可能污染可通过重复不哈添加剂的空白梯度来检测。当鉴别出流动相溶剂或组分被污染后，必须用干净的试剂代替原试剂。

另外，如果梯度条件设置错误也容易导致干扰峰的出现。如线性梯度被设置为台阶梯度

4.      色谱峰保留不重复

由于实际样品可能含有的强保留的杂质。如果梯度的zui终流动相组成仅为洗脱目标组分，则强保留的杂质可能会在色谱柱上发生聚集，因而会改变柱效和保留值。所以建议在梯度洗脱末尾时，保持强洗脱溶剂一段时间，以便清洗色谱柱，保证更好的重复性。

梯度洗脱中，在一次进样结束后，应该用初始流动相平衡色谱柱一段时间后，再进行下一次实验。如果不能*平衡柱子，色谱图中的早期谱峰的保留值和分离效果会发生改变。柱平衡一般需要5~10倍柱体积的初始流动相（如4.6×150mm的色谱柱为7~15ml）。然而，这一平衡体积也会随流动相和样品而异，需要试验人员对平衡体积进行试验。