一、实验仪器及试剂

1.器具电子天平、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、镊子、刀片。

2.试剂

 (1)固定剂：FAA

 (2)脱水剂：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；丙酮

(3)树脂：Spurr树脂

(4)染色剂：1%碱性品红

二、实验步骤

1.取材和固定：取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。一般样品块的大约为1立方毫米，取材完成后立即放入固定液中，真空泵抽气两到三次，每次1-2min（注意不要让固定液沸出，如抽完后液体较少，可再补加固定液）。

2.脱水：用50%、60%、70%、85%、95%、100%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理10～15min

3.置换

(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml丙酮，处理材料10min

(2)向管瓶中追加1ml丙酮，处理材料10min

(3)向管瓶中再追加2ml丙酮，处理材料10min

(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和丙酮混合液，加入纯丙酮3次，每次10min。

4.浸透

(1)在管瓶中加入1ml丙酮，向内滴入1滴Spurr树脂，1～2h

(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，放置1～2h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。

(3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的丙酮和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%～60%左右，2～3h

(4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr树脂的混合液，加入0.5～0.8ml的Spurr树脂，2～3h

(5)更换新配制的Spurr树脂1ml，过

(6)重复换树脂3次，每次12h

5.包埋与聚合

(1)先将恒温箱调至温度至70℃，包埋模事前烘干置干燥器中存放。

(2)在湿度小的房间里进行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙签不损伤样品地桃)，用滴管吸取新配制的Spurr树脂，并注满每个穴孔，用牙签拨样品，使样品按一定方位(有利修块、切片和观察)排列。做好记载(各穴孔中放的是什么样品

(3) 聚合：将包埋样品的包埋模放入70℃恒温箱中聚合，8h后取出置干燥器中存放。多余的树脂可放在胶囊中或放在包埋模的穴孔中同样品一同聚合。

6.修块

用锉刀或铁砂皮磨样品块，使样品稍稍暴露，使待切部位呈方形或长方形，zui后用刀片将样品块的磨面切平

7.玻璃刀的制作

用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块，然后再将每正方块制作成2把璃制刀。

8.切片、贴片

(1)固定样品块和玻璃刀

将样品块和玻璃刀固定在半薄切片机上，玻璃刀的避样品角约为5度，切片机装样品部位平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置，使刀口接近样品块。

 (2)荒切

开动切片机，调节进刀距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。

(3)切片

当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。

(4)贴片

当切到理想切片时，用尖头镊子夹住切片，并把切片释放到滴有水滴的载玻片的水滴上，然后将载玻片放到烤片机上45℃烤片，当载玻片上的水滴被烤干时切片就被贴在载玻片上。

(5) 染将碱性品红染液均匀覆盖在载玻片上，45℃烤干，随后用50%乙醇冲洗，并再次把切片烘干。

(6)封片，观察

注意：透射电镜样品固定液为2.5%戊二醛溶液