QB/T2591-2003抗菌塑料的抗菌性能试验方法
时间：2009-03-28 阅读：6388
前 言
本标准规定了抗菌塑料的抗菌性能试验方法和对抗菌效果的评价。本标准的抗菌性能要求和试验方法对应于日本国家工业标准JIS Z 2801—2000《抗菌加工制品——抗菌性试验方法和抗菌效果》（英文版），及美国材料与试验协会标准ASTM G 21—1996《合成高分子材料耐真菌性的测定》（英文版）。本标准与JIS Z 2801—2000和ASTM G21—1996的一致性程度为非等效。
本标准的附录A和附录B为规范性附录。
本标准由中国轻工业联合会提出。
本标准由全国塑料制品标准化技术委员会归口。
本标准主要起草人：董晓旭、季君晖、李毕忠、颜乃泓、王友斌、陶志清、陈仪本。
本标准为发布。
引 言
抗菌塑料是一种新型的功能塑料，随着人们对生活质量要求的提高，其应用日益广泛。为保证国内抗菌塑料制品的质量，为抗菌塑料的评价提供统一的技术依据，特制定本行业标准。本标准主要提供抗菌塑料的试验方法和抗菌效果评价。对于抗菌塑料的其它重要性能，如产品的理化性能和安全性可参考其他相关标准，在本标准中不作明确规定。而抗菌效果的长效性问题比较复杂，需要进一步研究，本标准暂不涉及。
抗菌塑料——抗菌性能试验方法和抗菌效果
抗菌塑料——抗菌性能试验方法和抗菌效果
1 范围
本标准界定了抑菌、杀菌、抗菌和抗菌塑料的术语。
本标准规定了抗菌塑料抗菌性能的术语和定义、产品分类、抗菌性能要求和试验方法。
本标准适用于具有抑制/杀死细菌和（或）抑制/杀死霉菌作用的抗菌塑料，不适用于软质抗菌泡沫塑料和添加光触媒类抗菌剂的抗菌塑料。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本适用于本标准。
GB 4789.2 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定
3 术语和定义
本标准采用以下术语和定义。
3.1 抑菌
抑制微生物生长繁殖的作用，叫做抑菌。
3.2 杀菌
杀死微生物营养体和繁殖体的作用叫做杀菌。
3.3 抗菌
抑菌和杀菌作用的总称为抗菌。
3.4 抗菌塑料
具有抗菌作用的塑料称为抗菌塑料。
4 产品分类
按抗菌性能可分为三种类型：
a）抗细菌型（应符合表1的要求）；
b）抗霉菌型（应符合表2的要求）；
c）抗（细菌和霉菌）型（应同时符合表1和表2的要求）。
5 抗菌性能要求
5.1 抗菌塑料的抗细菌性能
抗菌塑料的抗细菌性能应符合表1的规定。
表1
| 项目名称 | 抗细菌率（%） | |
| Ⅰ | Ⅱ | |
| 抗细菌性能试验 | ≥99 | ≥90 |
| 注：抗细菌率（见附录A）符合Ⅰ≥99%的抗菌塑料可以报告有强抗细菌作用；抗细菌率符合Ⅱ≥90%的抗菌塑料可以报告有抗细菌作用。 | ||
5.2 抗菌塑料的抗霉菌性能
抗菌塑料的抗霉菌性能应符合表2的规定。
表2
| 项目名称 | 长霉等级 | |
| 抗霉菌性能试验 | 0级 | 1级 |
| 注：长霉等级（见附录B）符合0级的抗菌塑料可以报告有强抗霉菌作用；长霉等级符合1级的抗菌塑料可以报告有抗霉菌作用。 | ||
6 试验方法
6.1 抗细菌性能试验
按附录A规定的方法进行试验。
6.2 抗霉菌性能试验
按附录B规定的方法进行试验。
附 录 A
（规范性附录）
抗菌塑料——抗细菌性能试验方法
（规范性附录）
抗菌塑料——抗细菌性能试验方法
A.1 原则
本方法通过定量接种细菌于待检样品上，用贴膜的方法使细菌均匀接触样品，经过一定时间的培养后，测得样品中的活菌数，并计算出样品的抗细菌率。
本方法适用于抗菌塑料的抗细菌性能试验。
A.2 条件
A.2.1 主要设备
A.2.1.1 恒温试验箱（37±1）℃、冷藏箱（0～5）℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
A.2.1.2 灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、接种环、酒精灯。
A.2.2 主要材料
A.2.2.1 覆盖膜
聚乙烯薄膜，标准尺寸为（40±2）mm×（40±2）mm、厚度为（0.05～0.10）mm。如试验样品外型尺寸较小，可按其面积减小该覆盖膜尺寸，且保证样品覆盖膜部位所铺的菌浓度不变。用70%乙醇溶液浸泡1min，再用无菌水冲洗，自然干燥。
A.2.2.2 样品
A.2.2.2.1 阴性对照样品
编号A，是直径90mm或100mm的灭菌平皿的内平板。
A.2.2.2.2 空白对照样品
编号B,是未添加抗菌成分的塑料，标准尺寸为（50±2）mm×（50±2）mm、厚度不大于5mm。可用与抗菌塑料样基材相同的树脂、相同的加工工艺制成；也可直接从普通塑料制品（与抗菌塑料检测样基材相同）中裁剪，并尽可能选择表面平整的部分。若尺寸小于50mm×50mm，应不小于20mm×20mm，否则需将其重新加工制成标准尺寸。
A.2.2.2.3 抗菌塑料样品
编号C，是添加抗菌成分的塑料，推荐采用标准尺寸为（50±2）mm×（50±2）mm、厚度不大于5mm。若尺寸小于50mm×50mm，应不小于20mm×20mm，且覆盖膜面积也相应减小，否则将其重新加工制成标准尺寸。
以上A.2.2.2中的所有样品在试验前应进行消毒，建议用消毒剂（70%乙醇溶液）擦拭样品表面，1min后用无菌水冲洗，自然干燥。如不适于用消毒剂处理的样品，可直接用无菌水冲洗。
A.2.3 培养基和试剂
A.2.3.1 营养肉汤（NB）
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
制法：取上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值使灭菌后为7.0~7.2，分装后置压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30min。
A.2.3.2 营养琼脂培养基（NA）
1000ml A.2.3.1营养肉汤（NB）中加入15g琼脂，加热熔化，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值使灭菌后为7.0~7.2，分装后置压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30min。
A.2.3.3 试剂
A.2.3.3.1 消毒剂
70％乙醇溶液。
A.2.3.3.2 洗脱液
含0.80% NaCl的生理盐水。为便于洗脱可加入少量无菌表面活性剂（如吐温80）。用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液调节pH值使灭菌后为7.0~7.2，分装后置压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30min。
A.2.3.3.3 培养液
营养肉汤（NB）/ 生理盐水溶液。建议用于大肠杆菌的浓度为1/500，金黄色葡萄球菌的浓度为1/100。为便于细菌分散可加入少量无菌表面活性剂（如吐温80）制成。用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液调节pH值使灭菌后为7.0~7.2，分装后置压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30min。
A.2.4 检验菌种
a） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 6538
b） 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922
根据产品的使用要求，可选用其它菌种作为检验菌种，但菌种应由*菌种保藏管理中心提供。
A.3 操作步骤
A.3.1 菌种保藏
将菌种接种于营养琼脂培养基（NA）斜面上，在（37±1）℃下培养24h后，在（0~5）℃下保藏（不得超过1个月），作为斜面保藏菌。
A.3.2 菌种活化
将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h，每天转接1次，不超过2周。试验时应采用连续转接2次后的新鲜细菌培养物（24h内转接的）。
A.3.3 菌悬液制备
用接种环从A.3.2培养基上取少量（刮1~2环）新鲜细菌，加入培养液中，并依次做10倍递增稀释液，选择菌液浓度为（5.0~10.0）×105cfu/ml的稀释液作为试验用菌液，按GB 4789.2《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》的方法操作。
A.3.4 样品试验
分别取0.2ml A.3.3试验用菌液滴加在阴性对照样品（A）、空白对照样品（B）和抗菌塑料样品（C）上。每个样品做5个平行。
用灭菌镊子夹起灭菌覆盖膜分别覆盖在样品（A）、样品（B）和 样品（C）上，一定要铺平，使菌均匀接触样品，置于灭菌平皿中，在（37±1）℃、相对湿度RH＞90％条件下培养24h。
取出培养24h的样品，分别加入20ml 洗脱液，反复洗样品（A）、样品（B）、样品（C）及覆盖膜（用镊子夹起薄膜冲洗），充分摇匀后，取一定量接种于营养琼脂培养基（NA）中，在（37±1）℃下培养（24~48）h后活菌计数，按GB 4789.2《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定的方法》测定活菌数。
以上试验重复两次。
A.4 检验结果计算
将A.3.4中测定的活菌数结果乘以100为样品A、样品B、样品C培养24h后的实际回收活菌数值，数值分别为A、B、C，保证试验结果要满足以下要求，否则试验无效：
同一空白对照样品B的5个平行活菌数值要符合 （zui高对数值－zui低对数值）/平均活菌数值对数值≤0.3；
样品A的实际回收活菌数值A应均不小于1.0´105cfu/片，且样品B的实际回收活菌数值B应均不小于1.0´104cfu/片。
抗细菌率计算公式为：
R（%）=（B－C）/ B×100
式中：
R—抗细菌率（％）
B—空白对照样品平均回收菌数（cfu/片）
C—抗菌塑料样品平均回收菌数（cfu/片）
附 录 B
（规范性附录）
抗菌塑料抗霉菌性能试验方法
B.1 原则
本方法用以测定抗菌塑料在霉菌生长的条件下对霉菌的抑制作用。
本方法规定将一定量的孢子悬液喷在待测样品和培养基上，通过直接观测长霉程度来评价抗菌塑料的长霉等级。
B.2 条件
B.2.1 主要设备
B.2.1.1 恒温恒湿培养箱（28±1）℃和相对湿度RH＞90%、冷藏箱（0～10）℃、超净工作台、离心机、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
B.2.1.2 血球计数板、灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、灭菌离心管、灭菌锥形瓶、接种环、酒精灯。
B.2.2 主要材料
B.2.2.1 阴性对照样品
25mm×25mm无菌滤纸。
B.2.2.2 空白对照样品
编号A，是未添加抗菌成分的塑料，标准尺寸为（50±2）mm×（50±2）mm，厚度不大于5mm。可用与抗菌塑料样基材相同的树脂，相同的加工工艺制成；也可直接从普通塑料制品（与抗菌塑料样品基材相同）中剪裁，应保证表面平整。若尺寸小于50mm×50mm，应不小于40mm×40mm，否则将其重新加工制成标准尺寸。
B.2.2.3 抗菌塑料样品
编号B，是添加抗菌成分的抗菌塑料，标准尺寸为（50±2）mm×（50±2）mm，厚度不大于5mm。可用与抗菌塑料样基材相同的树脂，相同的加工工艺制成；也可直接从普通塑料制品（与抗菌塑料样品基材相同）中剪裁。若尺寸小于50mm×50mm，应不小于40mm×40mm，否则将其重新加工制成标准尺寸。
以上B2.2.2和B2.2.3中所有样品试验前均应进行消毒，建议用消毒剂（70%乙醇溶液）擦拭样品表面，1min后用无菌水冲洗，自然干燥。如不适于用消毒剂处理的样品，可直接用无菌水冲洗。
B.2.3 试剂和培养基
B.2.3.1 营养盐培养液
| 硝酸钠（NaNO3） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 磷酸氢二钾（K2HPO4） 氯化钾（KCl） 硫酸镁（MgSO4 ·7H2O） 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 蔗糖 | 2.0g 0.7g 0.3g 0.5g 0.5g 0.01g 30g |
制法：取上述成分加入1000ml 0.05%润湿剂水溶液中，加热溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值使灭菌后为6.0~6.5，分装后置压力蒸汽灭菌器内115℃灭菌30min。
B.2.3.2 营养盐琼脂培养基
1000ml B.2.3.1营养盐培养液中加入15g琼脂，加热熔化，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH值使灭菌后为6.0~6.5，分装后置压力蒸汽灭菌器内115℃灭菌30min。
B.2.3.3 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）
马铃薯用水洗净，去皮切成小块。称取200g，加1000ml蒸馏水，加热煮沸1h。然后用双层纱布挤出滤液，将滤液加蒸馏水1000ml，加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热熔化，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值使灭菌后为6.0~6.5，115℃灭菌30min。
B.2.3.4 试剂
B.2.3.4.1 消毒剂
70％乙醇溶液
B.2.3.4.2 洗脱液
土温80、N-甲基乙磺酸（N-methyltaurine）和二辛磺化丁二酸钠（Dioctyl Sodium Sulphosuccinate），以上润湿剂任选一种，制成含0.05%润湿剂水溶液，调节pH值使灭菌后为6.0~6.5，115℃灭菌30min。
B.2.4 检测菌种
| 序号 | 名称 | 菌号 |
| 1 | 黑曲霉（Aspergillus niger） | AS 3.4463等同ATCC 6275 |
| 2 | 土曲霉（Aspergillus terreus） | AS 3.3935 |
| 3 | 宛氏拟青霉（Paecilomyces Varioti） | AS3.4253 |
| 4 | 绳状青霉（Penicillium funicolosum） | AS3.3875 |
| 5 | 出芽短梗霉（Aureobasium Pullulans） | AS3.3984 |
| 6 | 球毛壳（Chaetoomium globsum） | AS3.4254或ATCC6205 |
根据产品的使用要求，可选用其它菌种作为检测菌种，但菌种应由*菌种保藏管理中心提供。
B.3 操作步骤
B.3.1 菌种保藏
将菌种分别接种在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，在（28~30）℃下培养（7~14）d后，在（5~10）℃下保藏（不得超过4个月），作为保藏菌。
B.3.2 菌种活化
将保藏菌接种在PDA斜面培养基试管中，培养（7~14）d，使生成大量孢子。未制备孢子悬液时，不得拔去棉塞。每打开1支只供制备1次悬液，每次制备孢子悬液必须使用新培养的霉菌孢子。
B.3.3 孢子悬液制备
在培养（7~14）d内B.3.2的PDA斜面培养基中加入少量无菌蒸馏水，用灭菌接种针轻轻刮取表面的新鲜霉菌孢子，将孢子悬液置于250ml锥形瓶内，然后注入40ml洗脱液。
锥形瓶中加入直径5mm的玻璃珠（10~15）粒与孢子混合，密封后置水浴振荡器中不断振荡使成团的孢子散开，然后用单层纱布棉过滤以除去菌丝。将其装入灭菌离心管中，用离心机分离沉淀孢子，去上清液。再加入40ml洗脱液，重复离心操作3次。
用B.2.3.1营养盐培养液稀释孢子悬液，用血球计数板计数，制成浓度为（1×106±2×105）spores/ml的霉菌孢子悬液。
6种霉菌均用以上方法制成孢子悬液，将6种孢子悬液混合在一起，充分振荡使其均匀分散。
混合孢子悬液应在当天使用，若不在当天使用应在（3~7）℃保存，4日内使用。
B.3.4 平板培养基制备
无菌平皿中注入营养盐琼脂培养基，厚度（3~6）mm，凝固后待用（48h内使用）。
B.3.5 霉菌活性控制
阴性对照样品（无菌滤纸）铺在B.3.4平板培养基上，用装有新制备的混合孢子悬液的喷雾器喷孢子悬液，使其充分均匀地喷在培养基和滤纸上。
在温度28℃，相对湿度90%RH以上的条件下培养7d，滤纸条上应明显有菌生长，否则应重新制备孢子悬液。
B.3.6 样品试验
同时空白对照样品A、抗菌塑料样品B也分别铺在B.3.4平板培养基上，喷孢子悬液，使其充分均匀地喷在培养基和样品上。每个样品做5个平行。
以上样品在温度28℃，相对湿度90%RH以上的条件下培养28d，若样品长霉面积不小于10%，可提前结束实验。
以上试验重复两次。
B.4 检验结果
取出样品需立即进行观察，空白对照样品A长霉面积应不小于10%，否则不能作为该试验的空白对照样品。
样品长霉等级：
0级 不长，即显微镜（放大50倍）下观察未见生长；
1级 痕迹生长，即肉眼可见生长，但生长覆盖面积小于10%；
2级 生长覆盖面积不小于10%。