淋巴细胞类型鉴定技术
时间：2009-12-07 阅读：2487
体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），包括了淋巴细胞和单核细胞，常用的方法是葡聚糖泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。用该法可去除红细胞、粒细胞等成分，即为PBMC，分离纯度可达95%。若需进一步纯化其中的淋巴细胞，可将PBMC铺于培养皿上，由于单核细胞易吸附玻璃，而留于平皿上，收集未吸附的细胞，即为富含淋巴细胞的悬液。若要分离T细胞，可用多种方法，如尼龙毛分离，抗CD3单克隆抗体，也有利用T细胞表面的CD2能结合绵羊红细胞（SRBC），使其形成花结（E-花结试验），比重增大，用密度梯度离心法将其与其他细胞分离。若要分离B细胞，可利用B细胞、单核细胞等能吸附尼龙毛的特性，将PBMC通过尼龙毛柱，B细胞吸附于柱上，T细胞被洗脱分离。如应用以下方法，通过检测淋巴细胞的某些表面标志，又可鉴定出淋巴细胞的类型及比例。
（一） 流式细胞术（flow cytometry） 是借助流式细胞仪（flow cytometer,FCM）对免疫细胞及其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。流式细胞仪集光学、流体力学、电子学和计算机技术于一体，对细胞作多参数定量测定和综合分析，包括细胞大小、核型、表面分子种类等。样品经多种荧光素标记的抗体染色，因荧光素吸收与发射光谱的波长不同，信号能同时被吸收，因而能同时分析细胞表面多个分子的表达及表达程度。可检测T细胞、B细胞、NK细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等及其比率，CD4+/CD8+T细胞比值，以及白血病、淋巴瘤的免疫学分类。此外，可借光电效应，微滴通过电场时出现不同偏向，因此可分类收集所需的细胞。该技术能以每秒约5 000个细胞的速度无菌收集细胞，一般一次分选纯度在95%~98%，而且保持细胞活性，可进一步研究使用。
（二） 磁珠分离法 将已知抗细胞表面标记的抗体交联于称为微珠（平均直径小于1.5μm）的磁性颗粒，与细胞悬液反应后，微珠借抗体结合于相应细胞群或亚群的表面。再将细胞悬液加于一柱内，并置磁场中，因微珠被磁场吸收，将磁珠结合的细胞与磁珠非结合的细胞分开。如利用抗CD4交联的微珠可将T细胞中的CD4+T细胞与CD8+T细胞分开，从而获得高纯度的CD4+T细胞。
综上所述，可以看出免疫学技术有很大的*性，可以直接从某些标本中检出微生物，也就是说应用制备的各种状态的抗体测定微生物性抗原，其敏感性可达几十个微克的水平。分析微生物学及分子遗传学检测技术则试图在传统的形态、培养及生化学试验的基础上，寻求更快速、简便而特异的新方法，但这些新方法大多仍不能脱离增菌培养的步骤，因为病原菌在病料标本中的数量有限，要适应各种分析方法的要求，在通常情况下，还必须进行培养，才能达到检测分析的目的。总之，由于新技术与电子计算机相结合，大大提高了反应的准确性、敏感性和快速性，常规检验的时间须以天来计算，而新的快速检验技术则缩短到以“时”计算，zui快的在一小时内即可报告结果，其准确性与常规法的相符率可达90%以上。