随着发光(luminescence)技术在多种生物实验中的广泛应用，生物发光(bioluminescence)技术越来越成为的生物检测手段。在这篇文章中，我们将详细讨论生物发光技术在生物检测中的应用，以及它与其它发光检测手段相比所显示出的优点。

1 生物发光的特点

根据产生光子的能量来源不同，发光可分为以下四大类，一是荧光(fluorescence)：依靠光子发光；二是化学发光(chemiluminescence)：依靠化学能量发光；三是辐射发光：依靠放射性能量发光；四是电能发光：依靠电能量发光。其中，生物发光(bioluminescence)是依靠天然的酶促化学反应产生的能量而发光，属于化学发光，它天然地存在于许多生物体内，例如萤火虫、深海里的水母和一些细菌。目前，在生命科学研究中，应用的是荧光和化学发光。而生物发光作为化学发光的重要类别，也日益受到广泛关注和应用。物质发光的机理是：分子首先受到激发，吸收能量，从稳定的基态跃迁到不稳定的激发态，而当它从激发态返回到基态时，能量就以光子的形式释放出来(图1)，检测发出的光子就能确定发光分子的存在。发光技术能否在生物检测中得到应用及其应用的范围，在很大程度上取决于激发分子的能量来源。因为激发能量的来源不同，其产生的相对信号强度(信号对本底的相对值)则不同，对检测器的灵敏度要求也不同。以生物发光和荧光为例：对于荧光来讲，一方面，由于荧光的光子能量吸收效率高，分子可以释放大量的光能，从而产生高强度的光信号，利于检测；另一方面，这种高流量的激发光子有时会严重干扰光感检测器发射光子的分析能力，同时也可能激发生物样品本身含有的荧光团，而产生其它非特异的发射光，进而导致实验本底过高。也正是由于荧光的这种特性，即报告基团中高强度的信号与高强度的实验本底共存，使得其检测相对信号强度的能力大大降低。对于生物发光来讲，它与荧光形成鲜明对照，因为生物发光依靠天然的酶促化学反应发光，不需要引进外源的光能，所以应用生物发光作为检测手段的报告基团的实验本底很底。虽然生物发光的信号强度没有荧光那么高，但由于其*的发光原理，生物发光可以比荧光敏感一百甚至一千倍以上。这是生物发光越来越成为很多生物研究领域的生物检测手段的原因之一。

在实际应用时，需要反复权衡信号强度的要求和实验本底的影响，以选择*的检测技术。在光子检测能力比较低的情况下，实验本底很大程度上取决于仪器检测的对象，例如显微镜和流式细胞仪，由于需要检测单个细胞光学信号的变化，对发射光信号的强度要求非常高，因此，荧光通常会成为这一类应用领域的。然而，当需要检测大量的生物样品的时候，对光子检测能力的要求就会相应降低，对降低实验本底的要求相应会增加，比如在检测单个试管样品、多孔培养板样品，或者对器官(如老鼠器官)进行图像分析的时候，生物发光因其低本底和高灵敏度而倍受欢迎。而且由于生物发光检测器不需要使用光学滤片，从而为缩短样品和检测器之间的距离提供了可能，由此也更加提高了检测的效率。生物发光的灵敏度可以达到10-20 mol，相当于6，000多个萤光素酶分子。对于一个有几百个细胞的生物样品来说，一个细胞里只要有几个分子的萤光素酶就可以被检测到。而且生物发光的高灵敏度使得它可以检测的浓度范围非常宽，大多数可以跨越6～8个数量级，而且现代生物发光检测仪技术的更新也使得如此大跨度的检测成为可能。另外，由于生物发光来源于天然生物体内的酶促化学发光反应，当将其引进生物样品内的时候，对正常的生物活动不会添加太多负面影响。而且，因为萤光素酶的底物在反应时是被包裹在萤光素酶分子的内部，从而可以在zui大限度上保护正常的酶促发光反应不受外界的干扰。

2 生物发光作为报告基因的应用及其优点

生物发光在生命科学研究中zui广泛的应用是作为监测基因转录活动的报告基因。其中，萤火虫体内天然存在的萤光素酶通常是研究人员的。萤火虫的萤光素酶是一个61kDa的单体蛋白，它主要催化作用于名为萤光素(luciferin)的萤光素酶底物，在有ATP和氧气存在的条件下产生黄绿色的光(发射光波长是560 nm)。

当使用报告基因来监测基因转录活性的时候，研究人员zui大的顾虑是引进外源的报告基因可能会影响正常的生物活性，尤其是当报告基因通常需要和生物体内自身细胞的分子活动相时，高浓度的外源基因会过分加重生物内部细胞活动的负担，从而影响正常的生理活动，甚至造成不正常的生理现象。因此，尽量降低报告基因的浓度就成为研究成功的关键。以绿色荧光蛋白为例，它是一类天然存在的发光蛋白，由于它能产生高强度的发射荧光，所以可以获得非常清晰、生动的显微图像，在单细胞生物图像分析中已经得到广泛应用。但因为清晰图像的产生通常需要绿色荧光蛋白高浓度表达，从而加重了生物内部细胞活动的负担，使得绿色荧光蛋白不适合作为监测基因转录活动的报告基因。所以在选择合适的报告基因时，特别是和绿色荧光蛋白相比较之后，生物发光由于其低表达和高灵敏度使其在众多的选择中脱颖而出。

监测基因转录活性要求报告基因能够快速监测目标基因细微的动态变化。细胞内报告基因的浓度取决于两大动态过程：即蛋白合成过程(受基因转录活性的调控)和蛋白降解过程。如果蛋白降解过程很慢，则会使蛋白高度稳定，从而会造成蛋白的本底表达水平过高，那么基因转录活性改变所产生的新蛋白的合成就不容易被检测到。这样一来，报告基因的表达就不能准确地反应基因转录活性的变化。实验证明，在萤光素酶的序列上添加蛋白降解序列，如小鼠鸟氨酸脱羧酶(mouse ornithine decarboxylase， ODC)中富含脯氨酸- 谷氨酸- 丝氨酸- 苏氨酸(proline-glutamate-serinethreoninerich，PEST)的序列，可以显着地提高检测技术的应答性，并且不会对检测手段的灵敏度造成太大影响。与之相反，由于绿色荧光蛋白的高表达和高稳定性，使得添加蛋白降解信号反而在很大程度上限制了检测的灵敏度。

为了进一步提高检测基因的效率，我们对萤光素酶基因序列的密码子进行了优化，使得它在多种哺乳细胞中的表达水平提高了5～10倍；同时，为了减少对基因的非特异性调控，我们也对萤光素酶的载体进行了优化，去除了载体上哺乳动物转录因子结合序列的保守序列，从而大大降低了实验的本底，显着提高了实验的相对信号强度。优化后的萤光素酶报告基因可以成功地应用在各项生物研究领域中，例如对肿瘤坏死因子信号转导的研究。肿瘤坏死因子是由单核- 巨噬细胞产生的能致肿瘤细胞坏死的活性因子，能加强中性粒细胞的吞噬和消化功能，促进其粘附于血管内皮和迁移出血管之外，并能激活转录因子NF- B调控的包括IL-1、GM-CSF在内的多种基因的表达。在外源表达NF- B萤光素酶报告基因的HEK293 细胞中，肿瘤坏死因子的刺激可以有效地使萤光素酶的表达提高1000 倍以上。同样的检测方法也可以成功地检测肿瘤坏死因子阻断剂对肿瘤坏死因子生物活性的阻断效率(IC50=0.77 nmol)。

3 生物发光的其它应用

生物发光的强度取决于酶促化学反应中的各个反应成分的浓度，包括荧光素酶浓度、ATP浓度和萤光素酶底物即萤光素的浓度。通常，在生物发光的检测体系中，如果保持其它成分的浓度过量且恒定，就可以检测与生物活性相关的某个特定成分的浓度变化。我们上面谈到的用萤光素酶作为报告基因来监测基因转录活性的实验，就是把萤光素酶浓度和基因转录活性直接关联起来，萤光素酶浓度是我们的zui终监测目标。此外，如果我们固定萤光素酶的浓度并使其过量，生物发光还可以用来监测与ATP或萤光素浓度相关的生物学活性。

通过检测萤光素的浓度来监测某一生物学活性的实验原理是：在萤光素上添加一个化学基团进行修饰，建立一个萤光素酶无法识别的"修饰"底物，而只有通过特定的生物反应切除这个化学基团，萤光素才能恢复活性，酶促反应才能发生，这样我们就可以把生物发光的强度和这个特定的生物反应起来。Asp-Glu-Val-Asp-6'-aminoluciferin是一个没有活性的萤光素衍生物，只有当半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)存在并切除这个四肽的序列，释放出游离的萤光素时，萤光素酶酶促反应才能发生。因为半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的活性是检测细胞凋亡的一个重要指标，这样的设计使生物发光成为一个有效的检测细胞凋亡的手段。当然这一设计也可以用于运用荧光的细胞凋亡检测上，即把同样四肽的序列加到荧光染料Rhodamine110上。但由于生物发光*的低表达和高灵敏度，在相同的实验条件下，运用生物发光研究细胞凋亡，其敏感性比运用荧光技术高将近一百倍。类似的设计也可以用来利用生物发光检测其它蛋白酶的活性，比如caspase-8、caspase-9、二肽基肽酶Ⅵ(DPPIV)、caspase-3、钙蛋白酶(calpain)、蛋白酶体(proteosome)等，并且还可以检测其它如CYP450活性、单氨氧化酶等的酶促反应。

生物发光zui早用于检测ATP的浓度，并且迄今为止仍然是快速检测细胞活力zui广泛使用的方法之一。与基于荧光的细胞活力检测方法(如使用tetrazolium)相比，用生物发光来检测哺乳细胞的生物活性，其敏感度要高达一百倍以上，而且只需要5 min。用生物发光来检测细菌的生物活性，灵敏度非常高，细菌个数小于10时，都可以被检测到。用生物发光检测ATP的方法还可用于检测消耗ATP的生物酶的浓度。以激酶为例，由于它可以作用于不同的磷酸盐受体，包括蛋白、脂类和多糖底物，这种方法可以作为一个通用的检测激酶活性的手段。zui近，我们利用cAMP对蛋白激酶A的调控和蛋白激酶A的激酶反应对ATP的消耗建立了一个检测cAMP浓度变化的生物发光检测方法。具体来说，细胞内cAMP的浓度可调节蛋白激酶A 的活性，而蛋白激酶A被激活后催化相应的磷酸化反应则需要消耗ATP，这样一来细胞内ATP浓度就会降低，因此，我们检测到的ATP的浓度就与蛋白激酶A的活性成反比，也与cAMP的浓度成反比。由于我们能够将生物发光和ATP浓度直接关联起来，所以我们建立了一个细胞内检测G蛋白-偶联受体活性或磷酸去脂酶活性的快速敏感的检测方法。

4 结语

生物发光在复杂的生物有机体研究中具有巨大的潜力和价值。无论是它在很低的浓度下就可以发出清晰并定量的信号这一特性，还是它在哺乳细胞中低本底的优点，都使得生物发光技术在揭示生命奥秘的过程中拥有*的地位。因此，生物发光检测技术必将在基础生命科学研究和新药开发等诸多领域发挥越来越强大的作用。