胰岛素ELISA试剂盒

（德国DRG：EIA2935）

1、前言说明

DRG公司的胰岛素酶免试剂盒可用于人血清和血浆中（加入了肝素或柠檬酸的血浆）胰岛素的定量检测。此检测试剂盒仅供体外诊断用。

胰岛素是调节葡萄糖代谢的主要激素，它由朗格汉氏小岛的β细胞合成分泌，并以前胰岛素的前体形式存在，前胰岛素可加工形成C肽和胰岛素。这两种激素都以等量形式分泌到门脉循环中。成熟的胰岛素分子由两条多肽链组成，A链和B链（分别21个和30个氨基酸）。这两条链通过键内二硫键而连接到一起。胰岛素的分泌主要受血浆葡萄糖浓度的影响，这种激素有一系列重要的代谢功能。它的主要功能是通过葡萄糖的运送来控制外周组织中葡萄糖的摄取和利用。胰岛素和其它低血糖激素的作用（如抑制肝糖原的异生和糖原分解）可被高血糖激素（胰高血糖素，肾上腺素，生长激素和皮质醇）的作用中和掉。在胰岛素依赖性的糖尿病（IDDM）和其它疾病例如垂体机能减退疾病中,胰岛素的浓度会明显降低。在非胰岛素依赖性的糖尿病患者、肥胖患者、胰岛素瘤患者和一些内分泌功能紊乱（如库欣综合症和支端肥大症）患者的体内，其胰岛素的水平会上升。

2、实验原理

DRG公司的胰岛素酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶联免吸附实验（ELISA）,反应板上的微检测孔包被有能结合胰岛素分子上*抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性胰岛素的病人样本在包被孔中与酶联物进行孵育，该酶联物是一种生物素标记的抗胰岛素抗体。孵育后，用洗涤液洗去未结合的酶联物。在第二次温育时，链亲和素过氧酶复合物结合到生物素化抗胰岛素抗体上，过氧酶复合物的结合量与样品中胰岛素的浓度成正比。加入底物液后，所显示的颜色强度与病人样品中胰岛素的浓度成正比。

3、试剂盒成分

1）       微孔板：12×8，96孔，包被抗胰岛素的单克隆抗体。

2）       零标准品 ：1支，3ml，即用，0μIU/ml。

3）       标准品1－5：5支，1ml，即用，6.25;12.5;25;50;100μlU/ml。

4）       酶联物：1支，5ml，即用，生物素化的鼠单克隆抗体。

5）       酶复合物：1支，7ml，即用，辣根过氧化物-链亲和素复合物。

6）       TMB底物液：1支 14ml 即用。

7）       终止液： 1支 14ml 即用 包含0.5M硫酸,请勿接触终止液，以免刺激或着烧皮肤。

8）       洗涤液：1瓶，30ml，40倍浓缩，见试剂准备。

注意：用样品稀释的零标准品视需要而定。

4、实验所需材料（但试剂盒不提供）

1）  酶标仪

2）  标准移液器

3）  吸水纸

4）  蒸馏水

5、试剂的储存与稳定性

所有的未开启的试剂在2－8℃下储存至保质期，不要使用过期的试剂。所有开启的试剂应在2－8℃下储存。一旦打开微孔板的包装，需将其重新密封。

6、样品的准备

将所有的试剂和所需要的板条在使用前平衡至室温。

洗涤液：用1170ml的蒸馏水稀释30ml浓缩的洗涤液，zui终得到的容积为1200ml，稀释好的洗涤液在室温下可稳定存放两个星期。

7、样品的收集

此ELISA试剂盒可使用血清也可使用（只有肝素或柠檬酸盐抗凝的血浆）血浆作为样品。

不能使用明显溶血﹑黄疸和脂血的样品。

血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，在室温下离心分离血清。

血浆：将全血采集到含有抗凝剂的离心管，采集后立即离心分离。

8、样品的储存：

样品盖好盖子后，可在实验前2-8℃下储存5天，要更长时间储存，应在-20℃下冻存。在开始实验前应避免反复冻融样品。

9、样品的稀释：

在*次实验中，要是样品的浓度高于zui高标准品，则样品应用按实验步骤所描述的10倍或100倍稀释。在计算浓度时需乘以此稀释度。

例子：

a）  按1：10稀释： 10μL的血清+90μL的零标准品（充分摇匀）。

b）  按1：100释稀：10μL按a）稀释的血清+90μL的零标准品（充分摇匀）

10、实验步骤

所有的标准品、质控品和样品都必须做双份检测以确保所有微孔的检测条件都一样。

1）将所需数目的板条置于板架上。。

2）用一次性吸嘴将标准品﹑质控品和样品分别25μL加入相应的检测孔中。

3）每孔加入25μL的酶联物。

4）充分混合10秒，在此步骤中充分混合非常重要。

5）室温下温育30分钟。

6）快速弃去检测孔中的内含物，每孔加入400μL的洗涤液洗板三次，在吸水纸上拍干以除去残余液体。注意：洗板步骤是否正确操作会明显影响实验的灵敏度和度。

7）每孔加入50μL的酶复合物。

8）在室温下温育30分钟。

9）快速弃去检测孔中的内含物，每孔加入400μL的洗涤液洗板三次，在吸水纸上拍干以除去残余液体。

10）每孔加入50μL的底物液。

11）在室温下温育15分钟。

12）每孔加入50μL的终止液终止反应。

13）在加终止液后10分钟内于450±10nm处读取OD值。

11、计算结果：

1）     计算标准品﹑质控品和病人样品的平均吸光度。

2）     以吸光率为Y轴，浓度为X轴，按照从标准品中获得的平均吸光率和其相对应的浓度值，绘制一条标准曲线。

3）     利用样品的平均吸光率，在标准曲线上得出其相应的浓度值，

4）     自动方法：使用计算机三次方模式﹑四参数模式或双对数函数的计算机程序可得到结果。

5）     样品的浓度可从标准曲线上直接获取。样品的浓度高于zui高标准品的浓度则需进一步稀释。在计算浓度的时候，要乘以样品的稀释倍数。

下面是胰岛素ELISA的标准曲线的典型例子。

参考值：

建议各实验室建立自己的正常值与非正常值。

在一明显正常成年人的研究中，用DRG公司的胰岛素ELISA试剂盒进行检测得到如下数值：2-25μIU/ml

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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