去甲肾上腺素ELISA Kit使用说明书
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去甲肾上腺素ELISA Kit使用说明书
（德国IBL：RE59261）
1、应用范围
此试剂盒可用于人血清和尿液中去甲肾上腺素的体外定量检测。
2、临床意义
儿茶酚胺类激素肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺主要由肾上腺髓质、交感神经系统和大脑产生。它们几乎影响所有的组织，并与其它激素和神经系统一起参与各种生理过程的调节。在许多疾病中，儿茶酚胺激素及其代谢产物变肾上腺素和去甲变肾上腺素的分泌量都会增加，因而这些激素可用于疾病的诊断。所以，这些激素的检测对于疾病的诊断及神经系统肿瘤疾病的具有重要意义。它主要用于嗜铬细胞瘤的诊断，当然也用于成神经细胞瘤和神经节细胞瘤的诊断。因为在实验一开始时有提取步骤，用户可使用各种动物材料进行实验。所有动物的儿茶酚胺的化学结构相同，因此此试剂盒可用于测大鼠、小鼠或其它动物。
3、实验原理
此固相ELISA试剂盒利用的夹心法原理。微孔中包被了羊抗兔抗体。之后加入的液态抗体可以结合到抗原分子的一个抗原决定簇上，而抗原分子可在温育期内结合到固相抗体上。样品中的抗原与酶标二抗一起在微孔内温育，此酶标二抗可结合到抗原分子上的另一不同表位上。加入底物液后，溶液所显示的颜色强度与样品中抗原的量成正比。样品的结果可直接从标准曲线上读取。
4、贮存与稳定性
试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8℃，避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。开封的试剂盒在有效期内稳定，前提是将试剂盒用袋子密封并储存于2-8℃的环境下。
5、样品的采集与储存
| 注意 | 人体内的儿茶酚氨和间甲肾上腺素的释放会受到一些食品和药物的影响。因此在样品采集前72小时内病人应禁止服用下列食物和药品：维生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制剂，还有降血压类药物。 |
血浆（EDTA）
| 注意 | 血液采集后两小时内，将血液样品冷藏于2-8℃的环境下直致离心获取血浆。 | ||
| 注意静脉穿刺采集全血的常规注意事项。从采集到血液样品的那一刻起到检测时都应保持血液样品的化学整体性。不要使用明显溶血、黄疸的和脂血样品。如果样品出现混浊，则在实验前应当离心以除去所有的微粒物质。 | |||
| 贮存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。 |
| 稳定性 | 6h | 1个月 | |
尿液
| 可以是自然尿液也可使用24h尿液。将病人24h内的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐剂的试剂瓶中。 | ||
| 贮存 | ≤-20℃ | 避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。 |
| 稳定性 | 6个月 | |
6、试剂盒成分
注意：试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测所需的试剂成分
| 数量 | 标志 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，单克隆）。 |
| 1×6×2.5ml | CAL A-F | 标准品A-F，即用 肾上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml（0;8;27;82;273;819nmol/L） 去甲肾上素:0;5;15;50;150;500ng/mL（0;30;89;296;887;2955nmol/L） 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL（0;78;228;750;2938;14688nmol/L） 内含[-]肾上腺素，[-]去甲肾上腺素，[-]多巴胺（有生物活性）,0.1M的HCl |
| 1×2×2.5ml | CONTROL 1+2 | 质控品1+2 即用,含: [-]肾上腺素，[-]去甲肾上腺素，[-]多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl,具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签. |
| 1×250μL | ENZCONJ CONC | 酶联物 浓缩型（100×） 内含：碱性磷酸酶标记的抗体，Tris缓冲液，HCl，0.01%的NaN3 |
| 2× | EXTRPLATE | 提取板（微孔板） 每板24孔，包被了硼酸亲和凝胶。 |
| 1×60ml | EXTRBUF | 提取缓冲液 粉红色，即用，内含：0.016%的NaN3 |
| 2×1.25ml | COMT LYO | COMT冻干粉 内含：儿茶酚-氧位-甲基转移酶（猪肝），NaN3 |
| 1×2ml | COMT ADD | COMT添加剂 内含：人血浆，稳定剂，0.01%硫柳汞。 |
| 1×7ml | ANTISERUM DO | 去甲肾上腺素抗血清 紫罗兰色，即用，内含：抗去甲肾上腺素抗体（兔），缓冲液，稳定剂。 |
| 2×1.25ml | COENZ | 酶联复合物 即用，内含：S-腺苷-L-蛋白酸，稳定剂。 |
| 1×3ml | ENZBUF | 酶缓冲液 即用，内含：Tris缓冲液，HCl，稳定剂。 |
| 1×17ml | RELEASEBUF | Release缓冲液 黄色，即用，内含：0.1M的HCl，指示剂。 |
| 1×3ml | ACYLREAG | 酰化试剂 即用，内含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。 |
| 1×50ml | WASHBUR CONC | 洗涤液 浓缩型（10×） 内含：Tris缓冲液，HCl，吐温，0.2%的NaN3 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片 内含：对硝基苯磷酸（PNPP） |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物缓冲液 即用，内含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP终止液 即用，内含：1M的NaOH，0.25M的EDTA |
| 3× | FOIL | 粘性金属板 |
7、实验所需器材（但试剂盒不提供）
1） 移液器（10；10-100；100-1000μL）
2） 轨道摇床（200-900rpm）
3） 旋涡混合器
4） 带储器的8通道移液器
5） 洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统
6） 酶标仪
7） 双蒸水或去离子水
8） 吸水纸，取样吸头，计时器
8、实验前说明
| 注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。，下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
8.1样品的稀释
如果样品中去甲肾上腺素浓度高于zui高标准品的应按照下列所述进行稀释：
| 样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
| 血浆 | 去甲肾上腺素浓度高于zui高标准品中去甲肾上腺素的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
| 尿液 | 去甲肾上腺素浓度高于zui高标准品中去甲肾上腺素的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
8.2样品、标准品和质控品的提取（提取板，手动操作版）
| 1） | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。 |
| 2） | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
| 3） | 盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
| 4） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
| 5） | 每孔加入2ml双蒸水 |
| 6） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
| 7） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
| 8） | 每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。 |
| 9） | 在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板） |
| 10） | 快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
| 11） | 每孔加入2ml双蒸水。 |
| 12） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
| 13） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
| 14） | 每孔加入300μL Release缓冲液。 |
| 15） | 在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板） |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。
9、实验步骤
9.1 COMT酶溶液的准备
| 注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置。 |
| 在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液zui后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
9.2样品、标准品和质控品的酶分化
| 注意 | 如果要检测肾上腺素和去甲肾上腺素，我们建议您先检测肾上腺素。如果使用自动置换型衣液器加样，请将取样吸头内的残余液体加入到提取板的相应微孔内，否则剩余的提取液不够去甲肾上腺素检测用。将提取板放到有一定坡度的位置上。实验开始前，确定好肾上腺素和去甲肾上腺素的检测孔并标记好。 |
9.3尿液与血浆中的去甲肾上腺素
| 1 | 在每一微孔内加入25ul临时配制的COMT酶溶液，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
| 2 | 将提取好的标准品、质控品和样品分别25ul加入到相应的微孔内。在此步骤中，我们可以将取样吸头直接深入到COMT溶液里。加样后，溶液颜色变成粉色，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
| 3 | 向每一微孔中加入50ul去甲肾上腺素抗血清（蓝色）。 |
| 4 | 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育120min。 |
8.4冻干粉或浓缩成分的准备
| 稀释 | 成分 |
| 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 |
| 20ml | 洗涤液 | 180ml | 双蒸水 | 1：10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
| 60μL | 酶联物 | 6ml | 洗涤缓冲液（已稀释好） | 1：101 | 临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 30min |
| 4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物缓冲液 |
| 临时配置，仅能使用一次 | 18-25℃ | 10min |
9.5 ELISA实验步骤
1） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300ul稀释好的洗涤液洗板4次。zui后在吸水纸上拍干以除去残余液体。
2） 在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。
3） 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育60min。
4） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300ul稀释好的洗涤液洗板4次。zui后在吸水纸上拍干一除去残余液体。
5） 如果可以的话，使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。
6） 在每一微孔中加入200ul底物液。
7） 不要盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育60min。
8） 在每一微孔内加入50ulPNPP终止液以终止酶反应。轻轻振板以使溶液混合均匀。
9） 加终止液后60min内405nm处读取OD值。
10、期望值
实验结果不能当作判断任何治疗结果的*因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：
|
| 尿液 | 血浆 | ||
| μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
| 去甲肾上腺素 | ＜90 | ＜535 | ＜600 | ＜3.55 |
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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