组胺ELISA Kit使用说明书
时间：2011-10-12 阅读：1845
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深圳市科润达生物工程有限公司 -
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组胺ELISA Kit使用说明书
（德国IBL：RE59221）
1、应用范围
此试剂盒可用于人血浆和尿液中组胺的体外定量检测。深化此实验可用于细胞培养上清液的研究。
2、前言说明
组胺（β-咪唑乙胺）是人体中zui重要的介质，它主要存在于过敏反应的起始阶段（速发型过敏）。组胺是由组胺酸经脱氨基作用产生的。组胺几乎存在于机体的所有组织中，主要储存于柱状细胞和嗜碱性粒细胞的异染性颗粒中。组胺通常都是以无活性的复合体性存在，只有当需要的时候才会释放。像其它的介质一样，组胺不仅能调节过敏反应的各种临床症状，也可以调节终止过敏反应的一系列效应。组胺在组织中的生物活性是通过三种受体来完成的，它们分别是H1，H2和H3受体。临床检测组胺的方法有：定量检测各种速发型过敏反应中嗜碱性白细胞释放组胺的量，也可以检测过敏药物治疗后各种体液（血浆，尿液，细胞培养上清）中组胺的量。
3、实验原理
此ELISA试剂盒利用的是竞争法的原理。样品中未知量的抗原和一定量的酶标抗原竞争性结合到包被在微孔中的抗体结合位点上。温育后洗板以终止竞争反应。加入底物液后，溶液所显示的颜色强度与样品中抗原的量成反比。样品的实验结果可以从标准曲线上直接获取。
4、储存与稳定性
试剂盒必须在2-8℃的环境下运输和储存，避免太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂准备将在相关章节中阐述。如果将包被板密封并储存于2-8℃的环境下时，试剂在有效期内稳定。
5、样品的采集与储存
血浆（EDTA，肝素）
| 按照静脉穿刺的常规注意事项采集样品，血液样品自采集到实验时都必须保证其化学完整性。不要使用明显溶血、黄疸和脂血样品。混浊的样品应当在实验开始前离心以除去所有的颗粒性物质。 | ||||
| 储存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太阳直射，避免反复冻融。 |
| 稳定性 | 5小时 | 3个月 | 2年 | |
尿液
| 实验必须使用自然产生的尿液，也可使用24小时内产生的尿液。收集病人24小时内产生的尿液，并混合于含10-15ml 6N HCl防腐剂的容器中。为了计算结果，请确定尿液的总体积。实验开始前请先将样品离心。 | ||||
|
| 自然的尿液 | 酸化尿液 |
| 避免太阳直射，避免反复冻融。 |
| 储存 | 2-8℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ | |
| 稳定性 | 8小时 | 3天 | 6个月 | |
细胞培养上清
| 使用细胞培养上清作样品，一般没特殊注意事项 细胞培养基内的组胺浓度可能稍微要高些。 |
全血
| 全血中组胺释放量的检测必须用肝素化全血，具体信息请见相应的说明书（RE95000） |
6、试剂盒成分
注意：试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测所需的试剂成分
| 数量 | 标记 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
| 1×5ml | ANTISERUM | 组胺抗血清，蓝色，即用，内含：兔抗血清、Tris缓冲液和0.01%的硫柳汞 |
| 1×75ul | ENZCONJ CONC | 酶联物，200倍浓缩，内含辣根过氧酶标记的组胺。 |
| 7×0.4ml | CAL P A-G LYO | 血浆标准品A-G，冻干，用于血浆样品的定标。内含：组胺、人血浆。具体浓度请见试剂瓶标签或质控单。 |
| 2×0.4ml | CONTROL P1+2 LYO | 血浆质控1+2，冻干，内含：组胺、人血清。具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签。 |
| 1×2.0ml 5×0.25ml | CAL U/C A-F | 尿液/细胞培养标准品A-F，0;2.7;8.1;24.3;73;219ng/ml,即用，用于尿液和细胞培养样品的定标。内含：组胺和0.1M的HCl。 |
| 2×0.25ml | CONTROL U/C 1+2 | 尿液质控1+2，即用，内含：组胺、人尿液（酸化的）。具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签。 |
| 1×2.25ml | ACYLREAG | 酰化试剂，即用，内含：DMF |
| 1×60ml | ASSAYBUF CONC | 检测缓冲液，5倍浓缩，内含Tris缓冲液、吐温、BSA和0.05%的硫柳汞。 |
| 1×50ml | WASHBUF CONC | 洗涤液，20倍浓缩，内含磷酸缓冲液、吐温和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×10ml | INDICATORBUF | 指示缓冲液，紫色，即用，内含：Tris缓冲液、苯酚（pH＜7.5时颜色会发生改变＝和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×12ml | TMB SUBS | TMB底物液，即用，内含TMB、缓冲液和稳定剂。 |
| 1×12ml | TMB STOP | TMB终止液，即用，1M的H2SO4。 |
| 3× | FOIL | 粘性金属板 |
7、实验所需器材但试剂盒不提供
1）移液器，体积：10;20;50;100;1000ul
2）试管（12×75mm）
3）试管架
4）振荡器
5）旋涡混合器（500rpm）
6）带储器的8道移液器
7）洗涤瓶，自动或半自动洗板机
8）酶标仪（参考波长：600-650nm）
9）蒸馏水或去离子水
10） 吸水纸、取样吸头和计时器
8、实验前的准备说明
| 注意 | 96人份的试剂盒可分成三份分别进行检测，下述体积为检测32人份时所需要的体积。 |
8.1冻干或浓缩成分的准备
| 稀释/溶解 | 成分 |
| 稀释剂 | 比例 | 备注 | 储存 | 稳定性 |
| 20ml | 检测缓冲液 | 100ml | 蒸馏水 | 1：5 |
| 2-8℃ | 2周 |
| 15ml | 洗涤液 | 300ml | 蒸馏水 | 1：20 | 18-25℃将晶体溶解掉 | 2-8℃ | 4周 |
|
| 血浆标准品 | 0.4ml | 蒸馏水 |
| 静置15min,混合时无泡沫 | -20℃ | 1个月 |
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| 血浆质控品 | 0.4ml | 蒸馏水 |
| 静置15min,混合时无泡沫 | -20℃ | 1个月 |
| 10ul（*） | 酶联物 | 2ml | 检测缓 冲液 | 1:200 | 临时配置,只能使用一次 | 18-25 ℃ | 30分钟 |
（*）在稀释前,确保塞子内无残留液体.
8.2样品的稀释
样品中组胺浓度高于zui高标准品的样品,应当在酰化前用相应的稀释液稀释,尿液样品用0.1M的HCl,血浆样品用样品稀释液（Cat.no. KEHP711）,试剂盒内未提供。
8.3样品的酰化
用试管准备样品
| 注意 | 不能血浆标准曲线确定酰化尿液或细胞培养样品中组胺的浓度,也不能用U/C标准曲线确定酰化血浆样品中组胺的浓度. |
8.3.1血浆
| 1 | 将血浆标准品、血浆质控品和病人样品分别100ul加入到相应的试管中。 |
| 2 | 在每一试管中加入100ul指示缓冲液，旋涡混合。 |
| 3 | 在每一试管中加入20ul酰化试剂，加入酰化试剂后立即旋涡混合。 |
| 4 | 将试管盖好，室温（18-25℃）温育30分钟。 |
| 5 | 在每一试管中加入750ul已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。 |
8.3.2尿液，细胞培养上清
| 1 | 将U/C标准品、尿液质控品和病人尿液或细胞培养上清分别50ul加入到相应的试管中。 |
| 2 | 在每一试管中加入50ul指示缓冲液，旋涡混合。如果指示剂变成无色，说明溶液的pH值很低，样品中含有很多酸性物质。在这种情况下，再向试管中加入50ul指示缓冲液直至溶液略带微红。 |
| 3 | 在每一试管中加入10ul酰化试剂，加入酰化试剂后立即旋涡混合。 |
| 4 | 将试管盖好，室温（18-25℃）温育30分钟。 |
| 5 | 在每一试管中加入2000ul已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。 |
注意：酰化处理好的样品可在2-8℃下存放一晚，-20℃环境下可存放2天。
9、实验步骤
| 1 | 将酰化处理过的标准品、质控品和病人样品分别50ul加入到相应的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul临时配置好的酶联物。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul组胺抗血清。 |
| 4 | 盖板，振荡器（500rpm）上室温温育3小时。 |
| 5 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应物，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
| 6 | 如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。 |
| 7 | 在每一微孔中加入100ul TMB底物液。 |
| 8 | 血浆：振荡器（500rpm）上室温温育40min。 尿液/细胞培养上清：振荡器（500rpm）上室温温育20min。 |
| 9 | 在每一微孔中加入100ul TMB终止液以终止底物反应。轻轻振板使溶液混合均匀。 |
| 10 | 加终止液后15min内450nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm） |
10、期望值
实验结果不能当作任何治疗结果的*原因，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：
| 血浆 | 尿液 | |
|
| 24小时尿液 | 自然产生的尿液 |
| ng/ml | ug/d | ug/g肌酐酸 |
| 0.2-1.0 | 5-56 | 8-53 |
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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