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胶回收常见问题及对策

时间:2010-12-09      阅读:1754

1. 没有回收到DNA片段
如在洗脱后,发现洗脱液中没有DNA 片段,请检查是否按瓶身标签,在洗涤液中加入了无水乙醇。
 

2. 提取率低
1) 融胶液为酸性缓冲液,如融胶后,其pH 值升高将影响提取得率。请加入0.1 倍体积的3M 乙酸钾(pH5.0)。
2) 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液,其pH 值较高,将影响DNA 的吸附。请更换新的电泳缓冲液后,再进行电泳,然后切胶。
3) 回收片断大小影响回收效率(见下图);
4) 在洗脱前,将洗脱液于30~60℃温浴,可提高提取效率适当延长洗脱时间可增加回收效率。
5) 正确估计胶大小,确保加入足够量的Binding Buffer;使胶*融解;
6) 提高Binding Buffer用量可提高小片断DNA回收效率.对于<100bp的DNA片断,可加入6倍体积的Binding Buffer;

3. 吸光度测量结果问题
吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度,所以请用与洗脱液体相同的液体,对测量样品进行稀释和调零。

4.如何计算提取率
1) 由于回收前样品中,往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等,所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率。
2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳,使用凝胶成像系统拍照后,用配套的软件进行电泳条带灰度对比。
3) 注意,电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响,请仔细操作,以减小误差。

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