离子交换柱层析操作步骤
时间：2014-04-09 阅读：4534
1.装柱：
1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;
1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;
1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱;
1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积;
2.柱的平衡与上样：
2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6; 2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;
3.洗杂蛋白：
3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
3.7用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
(具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)
4.解离目的蛋白：
4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
(具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)
5.柱的清洗与保存：
5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml; 5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml; 5.3用过滤去离子水冲洗50ml;
5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。