HPLC法测定谷物中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

     摘 要 用一种快速方便的 真菌毒素多功能净化柱处理样品,然后用液相色谱对谷物中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2进行测定。样品经乙腈-水（体积比84：16）提取，提取液通过真菌毒素多功能净化柱净化、浓缩，三氟乙酸（TFA）柱前衍生，C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。对添加两个浓度黄曲霉毒素的玉米样品进行加标回收实验，4种毒素的回收率均在90.44%～101.23%之间，B1、G1、B2、G2的zui低检测限分别为2.0、1.0、0.5、0.5ng/kg。实验结果表明，此法不仅定量准确，精密度高而且操作极为方便。

真菌毒素对粮食饲料的污染是一个性的问题，我国因是农业大国和人民以谷物为主食的饮食习惯，使真菌毒素的污染问题显得更为突出。黄曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一，对世界上30多个国家和地区进行的调查表明，危害程度排在*位的是黄曲霉毒素。它是由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的一组结构类似的化合物[1]，均为二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物。虽然黄典霉毒素（AF）的衍生物有20多种，目前已分离鉴定出的AF包括：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12种，但天然污染粮油食品的AF是B组和G组两大类，即AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。黄曲霉毒素的毒性，致突变及致癌作用已得到明确证实。它由强到弱的顺序依次为AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。 欧盟的黄曲霉毒素的*AFB1是4μg/kg。

    霉菌毒素的检测定量一直是个难点，目前黄曲霉毒素检测的国标方法有薄层色谱法、酶联免疫法、免疫亲和柱净化液相色谱法。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差、耗时长；而酶联免疫法虽操作简单、灵敏度高，但特异性差；免疫亲和柱液相色谱法是柱后衍生法，它对于高黄曲霉毒素含量的样品偏差较大。且柱后衍生不普及,给使用带来不便。本文所述方法用真菌毒素多功能净化柱快速净化，液相柱前衍生法简单方便，灵敏度和特异性高，又能避免氯仿等有毒试剂的使用,是一种值得推广的好方法。这种方法，在上不少试验室已得到确认，还被作为AOAC的*方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

    乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、*（分析纯）、去离子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能净化柱、液相色谱仪、2475荧光检测器。

1.2 标准品的准备

    标准品包括了黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2各单一标准液和混合标准液，溶剂为乙腈，黄曲霉素混合标准液的浓度为2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。单一标准液用来确定各自的保留时间，具体工作用混合标准液是将所提供标准液稀释10倍，用微量注射器分别取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀释标准液（具体浓度为200ng/ml的B1、G1；50ng/ml的B2、G2），和样品一样蒸干，用三氟乙酸衍生，定容于0.2ml流动相，故所得进针的浓度分别是：B1、G1为5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml；G2、B2为1.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。

1.3 样品

    实验所用样品包括玉米、小麦等，取代表样品5kg，粉碎，充分混合均匀，四分法缩至500g。因霉菌毒素分布不均匀，充分混合非常重要，必要时取样量加大（有地方建议取15kg）。

1.4 样品的提取和净化

    使用粉碎机将样品研细，称取25g研细样品置于250ml的烧瓶或搅拌瓶中。加入100ml乙腈-水（体积比84：16）溶液。在旋转震荡器上震荡1h。用漏斗、定性滤纸将其过滤到样品瓶中。转移8ml样品提取液通过PuriToxSR160真 菌毒素多功能净化柱，推出大约4ml的净化液（具体过程见图1），转移2ml已净化的提取液至洁净的棕色瓶 。在水浴60℃条件下用氮气吹干。

1.5 柱前衍生及液相色谱条件

    向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸，立即旋紧盖子。涡旋30s，在40℃烘箱中衍生15min，室温下氮气吹干混合物，用200μl水-乙腈（体积比85：15）溶解残余物并涡旋30s，将其转移到1.5ml的离心试管中以10 000r/min的速度离心5min，把已经制备净化好的150μl样品液转移到HPLC样品瓶，进样25μl。液相色谱条件见表1。

 2 结果与讨论

2.1 4种黄曲霉毒素的分离情况

    取50μl黄曲霉毒素混标工作溶液（浓度为B1、G1 200ng/ml；G2、B2 50ng/ml）于棕色瓶内，吹干，衍生，流动相定容，经液相色谱分离得出的标准色谱分离见图2。黄曲霉毒素G1、B1的浓度为50ng/mlG2、B2的浓度为12.5ng/ml。

 2.2 标准曲线及回归方程

    按实验方法进行测定，4种黄曲霉毒素的标准曲线、回归方程及检出限（按3倍信噪比计算）的测定结果见图3和表2。

 2.3 样品的加标回收实验

    取玉米样品一份，分别做两个浓度的加标回收实验。具体做法是：取8ml黄曲霉素空白样的提取液,分别加10μl和 25μl黄曲霉素混合标准液（1 000ng/ml黄曲霉素B1、G1以及250ng/ml黄曲霉素B2、G2）作为加标。经过和样品一样的处理,得出其zui后的理论浓度见下式。

    ①B1、G1浓度：（0.010ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=12.5ng/ml；

（0.025ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=31.25ng/ml。

    ②B2、G2浓渡：

（0.010ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=3.125ng/ml；

（0.025ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=7.812 5ng/ml。

 2.4 精密度实验

    按实验方法进行样品处理，对同一样品连续测定5次。

 2.5 样品调查

    从市面上抽取10份玉米样品,按此实验方法进行处理，结果为未检出黄曲霉毒素。此方法简便易行、快速准确、灵敏度高、检测限低，适合大批量检测，值得推广