反相液相色谱法分离和测定富马酸
时间：2011-11-03 阅读：4986
摘 要 采用反相液相色谱法测定富马酸。在μ-Bondapark C18色谱柱上以含0.5%乙酸的水溶液作为流动相能较好地分离富马酸和马来酸试样，当其流速为1.0 mL/min时，富马酸与马来酸的分离因子的分离度达1.52。该方法操作简便、快速、定量准确、可靠。
1 引 言
富马酸是一种重要的精细化工产品的原料。它可用于合成不饱和聚酯树脂，它与醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合剂，与苯乙烯的共聚物是制造玻璃钢的材料；它也是一种食品添加剂（酸味剂），并可用于合成新型防霉剂——霉克星。此外，它也是重要的医药原料，如反丁烯二酸铁用于冶疗小红血球型贫血的富血铁〔1〕。有关其残留的分析测定国内外已有报道〔2～5〕，但有关其工业生产的控制分析国内外尚未见报道。我们采用反相液相色谱法分离和测定工业产品中富马酸含量以及马来酸样品中富马酸杂质含量。实验结果表明，该方法*适合于工业产品中富马酸的含量的测定和马来酸试样中富马酸杂质的测定。
2 实验部分
2.1 试剂和仪器
Shimadzau LC-4A液相色谱仪；Waters 4801 液相色谱光谱检测仪；Waters 991二极管阵列检测仪；Shimadzu C-R2A色谱数据处理仪；
富马酸标准品：99%（浙江工业大学化工学院精细化工研究室）；马来酸标准品：98%（浙江工业大学化工学院精细化工研究室）；其它所用试剂均为分析纯试剂。富马酸及马来酸样品是由浙江工业大学精细化工研究室提供的小试合成样品。
2.2 液相色谱条件
色谱柱： C18色谱柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流动相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm（灵敏度为0.01 AU）。进样量：20μL。
富马酸是一种重要的精细化工产品的原料。它可用于合成不饱和聚酯树脂，它与醋酸乙烯的共聚物是良好的粘合剂，与苯乙烯的共聚物是制造玻璃钢的材料；它也是一种食品添加剂（酸味剂），并可用于合成新型防霉剂——霉克星。此外，它也是重要的医药原料，如反丁烯二酸铁用于冶疗小红血球型贫血的富血铁〔1〕。有关其残留的分析测定国内外已有报道〔2～5〕，但有关其工业生产的控制分析国内外尚未见报道。我们采用反相液相色谱法分离和测定工业产品中富马酸含量以及马来酸样品中富马酸杂质含量。实验结果表明，该方法*适合于工业产品中富马酸的含量的测定和马来酸试样中富马酸杂质的测定。
2 实验部分
2.1 试剂和仪器
Shimadzau LC-4A液相色谱仪；Waters 4801 液相色谱光谱检测仪；Waters 991二极管阵列检测仪；Shimadzu C-R2A色谱数据处理仪；
富马酸标准品：99%（浙江工业大学化工学院精细化工研究室）；马来酸标准品：98%（浙江工业大学化工学院精细化工研究室）；其它所用试剂均为分析纯试剂。富马酸及马来酸样品是由浙江工业大学精细化工研究室提供的小试合成样品。
2.2 液相色谱条件
色谱柱： C18色谱柱（30 cm×3.9 mm I.D）；流动相：含0.5%乙酸的水溶液；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm（灵敏度为0.01 AU）。进样量：20μL。
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在此操作条件下，富马酸和马来酸样品及其标准溶液的色谱图如图1所示。
图1 富马酸试样的色谱图
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富马酸和马来酸混合标准溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富马酸样品（fumaric acid sample）；c.马来酸样品（malic acid sample）。1.马来酸（malic acid）；2.富马酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色谱柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 标准溶液的配制
准确称取富马酸标准品约0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流动相稀释至刻度。然后逐步稀释得不同浓度的标准溶液，其浓度分别为1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 样品溶液的配制
准确称取一定量试样（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流动相稀释至刻度。然后逐步稀释至一定浓度，待测定。
3 结果与讨论
3.1 流动相选择
作者首先考察了不同流动相对试样中富马酸与其杂质的分离效果，发现试样在100%甲醇为流动相和以纯水为流动相时试样中的富马酸及杂质马来酸等出峰较快，基本上与溶剂一起流出，而当流动相为含乙酸水溶液时富马酸与马来酸等之间具有较好的分离效果，而且流动相中乙酸含量不同对其分离效果产生明显影响。
随着乙酸浓度的增加，马来酸的容量因子（k′1）随之减少，而富马酸的容量因子（k′2）先随乙酸浓度的增加而增加，当乙酸浓度＞1.0%时，其容量因子显著减少。从而使马来酸与富马酸之间的分离因子（α）和分离度（R）在流动相中乙酸浓度为1.0%时，两者均达到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同时考虑到色谱柱的使用寿命，我们认为采用含0.5%乙酸水溶液为流动相较为合适，因为当采用0.5%乙酸水溶液为流动相时，马来酸与富马酸之间的分离因子和分离度分别达1.62和1.52，已满足定量测定要求。
3.2 流速的影响
实验结果表明，当以含0.5%乙酸水溶液为流动相时，在室温下改变其流速时，其保留时间、柱效均发生变化，即随着流速的降低，保留时间和柱效随之增加，而容量因子（k′）基本不变。这是由于流速降低时，流动相中传质阻力Hm、停滞流动相中传质阻力Hsm和固定相内传质阻力Hs都降低，纵向分子扩散虽有所增加，但在此浓度范围内，前三项的影响是主要的，后一项可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是热力学参数，它与流动相的流速无关，因此流动相的流速的变化基本不影响马来酸与富马酸之间的分离因子，其α=1.57，流速选为1.0 mL/min。
3.3 检测波长的选择
富马酸是一个不饱和有机酸，它受紫外光的激发后可以发生σ→π*，π→π*，n→π*跃迁，因此它在紫外的短波区有强烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。实验结果表明，在乙酸/水体系中富马酸在λ=240 nm附近有强吸收。
乙酸浓度对富马酸和马来酸的紫外吸收带有着明显的影响，当乙酸浓度增加时，富马酸的zui大吸收波长显著向长波方向位移，即产生红移。当乙酸浓度从0.5%增加到2.0%时，富马酸的zui大吸收波长从236 nm位移至248 nm。并且，随着乙酸浓度的增加，两者的紫外吸收谱带变狭。为此，选用0.5%乙酸溶液为流动相时，测定波长选择为λ=240 nm。
3.4 溶剂的选择
实验结果表明，试样经甲醇溶解后采用不同溶剂稀释，其色谱图明显不同，如用水稀释时色谱图中产生一个较大的体系峰（负峰），而且该体系峰与马来酸的色谱峰非常接近；而采用流动相稀释时，体系峰较小，使体系峰与马来酸的峰*分离。因此，选择流动相作为稀释溶剂。
3.5 方法的线性范围和检测限
将不同浓度的标准溶液在上述选定的色谱测定条件下分别进行分析测定,进样体积为20 μL。以浓度（C）为横坐标,峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线。实验结果表明,富马酸的浓度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L内，富马酸的浓度与其峰面积呈现良好的线性关系,线性回归方程为A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的检测限为7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和准确度
为了考察该方法的重现性,对同一试样进行了5次重复测定的标准偏差为0.81,相对标准偏差为0.91%。
在已知含量的样品中加入一定量的标准品后进行多次测定。测得富马酸的回收率为 98.86%～103.9%,平均回收率为101.0%。
表1 样品中富马酸含量测定结果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
样 品
Sample 测定结果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
马来酸样品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富马酸样品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 实际样品的测定
该方法用于测定富马酸和马来酸样品中富马酸含量，结果见表1。实验结果表明，该方法*适合于富马酸产品和马来酸产品中富马酸含量测定。
作者单位：施介华（浙江工业大学化工学院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大学分析测试中心，杭州 310027）
References
［1］ Zhang Sigui（章思规），Xin Zhong（辛 忠）. Handbook of Preparation of Fine Organic Chemical Engineering（精细有机化工制备手册）. Beijing（北京）：Science and Technology Literature Press （科学技术文献出版社），1994:386～387
［2］ Chen Dayi（陈大义）. Chinese J. Preventive Medicine（中华预防医学杂志），1996，30（1）：52
［3］ Yu Zhaolou（余兆楼），Chang Liwen（常理文）. Chinese J. Chromatogr.（色谱），1992，10（6）：336～338
［4］ Dietz E A, Singley K F. J. Liq. Chromatogr., 1994, 17（7）:1637～1651
［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558
在此操作条件下，富马酸和马来酸样品及其标准溶液的色谱图如图1所示。
图1 富马酸试样的色谱图
Fig.1 Chromatogram of fumaric acid samples
a.富马酸和马来酸混合标准溶液（standard solution of fumaric acid and malic acid mixture）；b.富马酸样品（fumaric acid sample）；c.马来酸样品（malic acid sample）。1.马来酸（malic acid）；2.富马酸（fumaric acid）。
μ-Bondapark C18色谱柱（30 cm×3.9 mm I.D）。
2.3 标准溶液的配制
准确称取富马酸标准品约0.015 g（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流动相稀释至刻度。然后逐步稀释得不同浓度的标准溶液，其浓度分别为1.5×10-3，3.0×10-3，4.5×10-3，6.0×10-3，7.5×10-3，10.5×10-3，15.0×10-3 g/L。
2.4 样品溶液的配制
准确称取一定量试样（至±0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用5 mL甲醇溶解并用流动相稀释至刻度。然后逐步稀释至一定浓度，待测定。
3 结果与讨论
3.1 流动相选择
作者首先考察了不同流动相对试样中富马酸与其杂质的分离效果，发现试样在100%甲醇为流动相和以纯水为流动相时试样中的富马酸及杂质马来酸等出峰较快，基本上与溶剂一起流出，而当流动相为含乙酸水溶液时富马酸与马来酸等之间具有较好的分离效果，而且流动相中乙酸含量不同对其分离效果产生明显影响。
随着乙酸浓度的增加，马来酸的容量因子（k′1）随之减少，而富马酸的容量因子（k′2）先随乙酸浓度的增加而增加，当乙酸浓度＞1.0%时，其容量因子显著减少。从而使马来酸与富马酸之间的分离因子（α）和分离度（R）在流动相中乙酸浓度为1.0%时，两者均达到zui大值，即α=2.02，R=2.32。同时考虑到色谱柱的使用寿命，我们认为采用含0.5%乙酸水溶液为流动相较为合适，因为当采用0.5%乙酸水溶液为流动相时，马来酸与富马酸之间的分离因子和分离度分别达1.62和1.52，已满足定量测定要求。
3.2 流速的影响
实验结果表明，当以含0.5%乙酸水溶液为流动相时，在室温下改变其流速时，其保留时间、柱效均发生变化，即随着流速的降低，保留时间和柱效随之增加，而容量因子（k′）基本不变。这是由于流速降低时，流动相中传质阻力Hm、停滞流动相中传质阻力Hsm和固定相内传质阻力Hs都降低，纵向分子扩散虽有所增加，但在此浓度范围内，前三项的影响是主要的，后一项可忽略。因此，流速降低，柱效增大。而容量因子（k′）是热力学参数，它与流动相的流速无关，因此流动相的流速的变化基本不影响马来酸与富马酸之间的分离因子，其α=1.57，流速选为1.0 mL/min。
3.3 检测波长的选择
富马酸是一个不饱和有机酸，它受紫外光的激发后可以发生σ→π*，π→π*，n→π*跃迁，因此它在紫外的短波区有强烈的吸收，λmax,CH3OH=207 nm。实验结果表明，在乙酸/水体系中富马酸在λ=240 nm附近有强吸收。
乙酸浓度对富马酸和马来酸的紫外吸收带有着明显的影响，当乙酸浓度增加时，富马酸的zui大吸收波长显著向长波方向位移，即产生红移。当乙酸浓度从0.5%增加到2.0%时，富马酸的zui大吸收波长从236 nm位移至248 nm。并且，随着乙酸浓度的增加，两者的紫外吸收谱带变狭。为此，选用0.5%乙酸溶液为流动相时，测定波长选择为λ=240 nm。
3.4 溶剂的选择
实验结果表明，试样经甲醇溶解后采用不同溶剂稀释，其色谱图明显不同，如用水稀释时色谱图中产生一个较大的体系峰（负峰），而且该体系峰与马来酸的色谱峰非常接近；而采用流动相稀释时，体系峰较小，使体系峰与马来酸的峰*分离。因此，选择流动相作为稀释溶剂。
3.5 方法的线性范围和检测限
将不同浓度的标准溶液在上述选定的色谱测定条件下分别进行分析测定,进样体积为20 μL。以浓度（C）为横坐标,峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线。实验结果表明,富马酸的浓度在2.4×10-3～12.2×10-3 g/L内，富马酸的浓度与其峰面积呈现良好的线性关系,线性回归方程为A=0.1933C+0.0452（r=0.9979）。方法的检测限为7.7×10-2 mg/L（按信噪比2∶1）。
3.6 精密度和准确度
为了考察该方法的重现性,对同一试样进行了5次重复测定的标准偏差为0.81,相对标准偏差为0.91%。
在已知含量的样品中加入一定量的标准品后进行多次测定。测得富马酸的回收率为 98.86%～103.9%,平均回收率为101.0%。
表1 样品中富马酸含量测定结果
Table 1 Determination results of concentration of fumaric acid in sample
样 品
Sample 测定结果 Determination results （%） 平均值
Mean value （%）
1 2 3
马来酸样品 Malic acid sample 8.80 9.06 8.84 8.90
富马酸样品 Fumaric acid sample 88.74 87.50 87.96 88.07
3.7 实际样品的测定
该方法用于测定富马酸和马来酸样品中富马酸含量，结果见表1。实验结果表明，该方法*适合于富马酸产品和马来酸产品中富马酸含量测定。
作者单位：施介华（浙江工业大学化工学院，杭州 310032）
徐秀珠（浙江大学分析测试中心，杭州 310027）
References
［1］ Zhang Sigui（章思规），Xin Zhong（辛 忠）. Handbook of Preparation of Fine Organic Chemical Engineering（精细有机化工制备手册）. Beijing（北京）：Science and Technology Literature Press （科学技术文献出版社），1994:386～387
［2］ Chen Dayi（陈大义）. Chinese J. Preventive Medicine（中华预防医学杂志），1996，30（1）：52
［3］ Yu Zhaolou（余兆楼），Chang Liwen（常理文）. Chinese J. Chromatogr.（色谱），1992，10（6）：336～338
［4］ Dietz E A, Singley K F. J. Liq. Chromatogr., 1994, 17（7）:1637～1651
［5］ Llorente M, Villaroya B, Gomez-Cordoves C. Chromatographia, 1991, 32（11／12）:555～558