在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。

    那么用什么样的酶来标记抗原或抗体呢？

    1.酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大(即一个酶分子能催化几十几百个底物分子发生反应的酶)。

    2.酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。

    3.酶制剂易得、价廉.

    4.既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的免疫学特性，也不降低酶的活性。

    5.酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。

    6.要有安全、价廉、易得的底物。

    符合上述条件的酶有：碱性磷酸酶，一般用分子量为5×105(Alkaline Phospatase,简称AP)，辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,简称HRP,分子量为4×104),另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种(AP和HRP)zui为常用。

    AP活力高，制备好的酶结合物可加NaN3防腐，但此种酶不易获得，因其是从小牛肠粘膜中或大肠杆菌中提取，而且价格比较昂贵。因此，目前国内外大多使用HRP。HRP活性也高，价格较便宜。但制得酶结合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低温保存或加60%缓冲甘油等量混合后少量分装，保存冰箱，一般可用1-2年。

   结合：用什么样的方法将HRP与抗体球蛋白结合起来呢？当然不能用强烈的方法，因为强烈的方法会使酶和抗体失去活性。故只能用温和的方法把酶和抗体结合起来。因此，必须使用结合剂。理想的结合剂应具备下列条件：

1.不影响酶及抗体活性；

2.不产生干扰物质；

3.抗体和酶结合后应有较高的产量；

4.不出现非特异性反应；

5.结合程序简便；

6.来源易、价廉。

目前常用的有戊二醛和过碘酸钠二种。由于对所使用结合剂的针对性，因此标记的方法也有戊二醛交联法和过碘酸钠氧化法两类。