低背景化学发光检测试剂盒说明书
时间：2020-01-19 阅读：1920
低背景化学发光检测试剂盒说明书
cECL Western Blot Kit
目录号：YJ0048
保存条件：2-8℃避光保存。
组分说明
Catalog no. YJ0048B YJ0048C
Volume 50 ml 250 ml
发光剂 25 ml 125 ml
稳定剂 25 ml 125 ml
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途产品简介
低背景化学发光检测试剂盒是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶（HRP）配套使用
的的低背景底物检测试剂盒。本产品能够在HRP的催化下发生化学反应而发光，可用于
检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。其高灵敏度能够检测ng级别的抗原，发光信号
强烈持久，可以使用照相技术（X-光胶片曝光）或者其他成像方法（如荧光或化学发光
成像仪）进行检测。
注意事项
1. 为获得zui佳实验结果，请务必优化实验条件，包括检测样品的用量、一抗、二抗稀
释度、杂交膜及封闭试剂的选择，抗体孵育及膜洗涤步骤中请使用摇床辅助完成。
2. 由于奶粉中含有内源性生物素，在使用亲和素/生物素系统时，封闭液中应避免使用
奶粉。
3. 免疫印迹实验进行全过程中，使用充足的洗涤缓冲液、封闭液、抗体稀释液和底物
反应液以*覆盖印迹，确保印迹膜始终处于湿润状态，避免干燥。使用大量的封
闭液和洗涤液，可以降低非特异信号。
4. 由于叠氮钠是HRP抑制剂，在缓冲液中应避免使用叠氮钠作为防腐剂。
5. 在与膜发生接触过程中，请佩戴手套且使用干净镊子等洁净器材，避免蛋白污染及
高背景。
6. 避光条件下，配制好的化学发光检测底物工作液可在室温下稳定保存8小时。阳光
或其他强光会影响工作液，故应避免强光长时间的照射。正常实验室灯光短时间照
射不影响工作液的使用。
7. 上海研谨提供多种蛋白转移用膜、封闭液、一抗、酶标二抗、缓冲液等，详情请查
询目录或网站。
操作步骤
注意：务必使用推荐的抗体稀释浓度以获得阳性结果，zui佳抗原和抗体用量须通过预
实验来确定。
1．二抗孵育完毕后，将印迹膜充分洗涤。
2．根据需要量，将增强型发光剂和稳定剂按照1：1的比例等体积混合，配制为化学发
光检测底物工作液（例如：一张8 cm×6 cm的膜使用1 ml工作液）。
3．弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室
温孵育3-5分钟。
4．用移液器吸去多余发光底物工作液，将印迹膜置于两层干净的塑料薄膜之间，此过
程应小心完成，避免膜与膜之间产生气泡。
5．在暗室内进行X-光胶片曝光，或将膜放置到荧光、化学发光成像仪内，按照仪器说
明书进行检测。
注意：一抗推荐用量为50 ng/ml-1 μg/ml，二抗推荐用量为5 ng/ml-50 ng/ml。
相关实验材料
YJ0043 TBST(TBS with Tween-20，pH8.0) YJ0058 NC膜(0.45μm)
YJ0052 蛋白示踪上样缓冲液（还原） YJ2002 NC膜(0.22μm)
YJ0053 蛋白示踪上样缓冲液（非还原） YJ0059 PVDF膜(0.45μm)
YJ0054 WB封闭液I（BSA） YJ2003 PVDF膜(0.22μm)
YJ0055 WB封闭液II（奶粉） YJ0060 X线暗盒
YJ0056 蛋白印迹膜再生液 YJ0061 X光胶片
YJ0057 丽春红染色液 YJ0062 定影粉
YJ0044 Tris Glycine转膜缓冲液 YJ0063 显影粉
常见问题解答
问题
1.胶片反相（白色条带，黑色背景）
2.膜上出现棕色或黄色条带
3.暗室中看到强烈发光
4.发光信号持续时间过短
可能原因： 系统中HRP过量
解决方法：稀释HRP标记物至少10倍以上
问题：信号较弱或者无信号
可能原因：
a发光反应系统中HRP过多，消耗稀释底物过快，引起信号迅速降低
b抗原/抗体量不够
c蛋白转移率低
解决方法：
a稀释HRP 标记物至少10倍以上
b增加抗原/抗体使用量
c优化转移系统
问题：高背景
可能原因：
a系统中HRP过量
b 封闭不足
c 封闭试剂选择不当
d 冲洗不充分
e曝光过度
f抗原/抗体浓度过高
解决方法：
a稀释HRP标记物至少10倍以上
b优化封闭程序
c选择另一种封闭试剂
d增加冲洗时间，次数
e减少曝光时间
f降低抗原/抗体使用浓度
问题：蛋白条带为点状
可能原因：
a蛋白转移失败
b膜未平衡
c 胶片与膜之间有气泡
解决方法：
a优化转移过程
b按照说明书处理膜
C曝光前去除所有气泡
问题：出现非特异条带 （高背景、信号维持时间较短）
可能原因：系统中HRP过多
解决方法：稀释HRP标记物
问题： 出现非特异条带（背景干净信号维持时间正常）
可能原因：
1. 一抗用量过多
2. SDS导致非特异结合
解决方法：
1.进一步稀释一抗
2. 在实验过程中避免使用SDS
使用本产品的文献
Lu X, Zhang N, Meng B, et al. Involvement of GPR12 in the regulation of cell proliferation and survival. Mol Cell
Biochem. 2012 Mar 20
He J, Kang L, Wu T, et al. An elaborate regulation of mTOR activity is required for somatic cell reprogramming
induced by defined transcription factors. Stem Cells Dev. 2012 Apr 3
Lu X, Zhang N, Dong S, et al. Involvement of GPR12 in the induction of neurite outgrowth in PC12 cells. Brain
Res Bull. 2012 Jan 4;87(1):30-6.