尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG 酶）操作说明书
时间：2020-10-20 阅读：4066
尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）说明书
Uracil-N-Glycosylase
Cat. No. K0951
保存：-20℃
组分说明
Cat.No. K0951 K0951A
KitSize 200U 5×200U
Uracil-N-Glycosylase，1U/μl 200 μl 5×200 μl
产品简介
尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也称为尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，该蛋白分子量为25kD，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，并且对RNA无活性，主要应用于防止PCR扩增产物的污染。该酶作用机理为：在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。
单位定义
37℃，60分钟内催化1nmol尿嘧啶，从含尿嘧啶的DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。
质量控制
SDS-PAGE检测纯度大于95%；经检测无核酸内、外切酶活性。
注意事项
1. UNG长期储存(非频繁使用; 每月少于3次)请置于-70℃保存，每天或每周使用请于-20℃保存。尽量避免反复冻融，大包装建议分装使用。
2.UNG可以在PCR反应前先清除不慎污染的U-DNA分子，一个实验室必须在所有的PCR反应中使用dUTP作为dNTP之 一，使所有扩增产物都成为U-DNA。如单使用于某个检测，T-DNA仍会积累，此抗污染系统也难以起到*的作用。
3. UNG/dUTP系统是PCR试剂内部的一种防污染措施，为了防止PCR产物的污染，尤其是在临检实验室中反复放大同一片段时，必须严格规范实验室的分划和操作。
使用方法
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据具体实验进行相应的改进和优化。
1. PCR反应体系：
试剂 50μl反应体系 终浓度
TaqPCRBuffer，10× 5μl 1×
dATP，10mM 1μl 200μM
dGTP，10mM 1μl 200μM
dCTP，10mM 1μl 200μM
dTTP，10mM 0.5 μl 100μM
dUTP，10mM 1μl 200μM
ForwardPrimer，10μM 1μl 0.2μM
ReversePrimer，10μM 1μl 0.2μM
TemplateDNA Xμl
，
TaqDNAPolymerase 5U/μl 0.5μl
Uracil-N-Glycosylase，1U/μl 0.2μl
RNase-FreeWater upto50 μl
注意：TaqDNAPolymerase与Uracil-N-Glycosylase的反应缓冲液和酶储存液可以通用。
2. PCR 反应条件：
步骤 温度 时间
UNG消化 37℃-50℃ 5-10min
预变性 95℃ 10min
变性 94℃ 30s
退火 55-65℃ 30s 30-40 个循环
延伸 72℃ 1min
延伸
注意：通常将Taq酶与UNG酶按一定的比例加入终PCR反应体系中，先于72℃37℃-50℃范围内消化 5min5-10分钟，然后95℃10分钟灭活，（同时这一步也达到预变性和热启动的效果），随后进行PCR扩增。UNG酶的反应可以在37℃-50℃，5-10分钟的范围内变化，可以根据实验的需要进行调整。
实验代做服务：
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