Annexin V-Alexa Fluor 488/PI凋亡检测试剂盒说明书

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit

目录号：K2576    

保存：2-8  ℃避光保存

组分说明

Cat.No.                      K2576

KitSize                      50

4×BindingBuffer              10ml

PropidiumIodide,PI           500 μl

AnnexinV-AlexaFluor488      250 μl

产品简介

  AnnexinV-AlexaFluor488/PI 凋亡检测试剂盒是一种采用AnnexinV-AlexaFluor488 与PI 双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。

  细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。AnnexinV 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所*的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。另外一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通过完整的活细胞，但能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色，因此通常将AnnexinV 与  PI 配合染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。

注意事项

1.  消化细胞时不能用含EDTA 的胰酶。

2.  本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。

3.  需自备PBS 和去离子水。

4.  荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

5.  PI 对人体有刺激性，请注意适当防护。

6.  请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 细胞样品的准备：

   a. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

   b. 对于悬浮细胞：1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约                            50 微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约                                50μl 左右的   PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

2. 用去离子水按 1:4 稀释BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去离子水）；

3. 用 250μlBindingBuffer 重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/ml；

4. 取100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入5μlAnnexinV-AlexaFluor488 和             10 μl20μg/ml 的 PI 溶液；

5. 混匀后于室温避光孵育 15 分钟；

6. 在反应管中加 400μlPBS，流式细胞仪（FACS）分析。



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