一步法快速WB（HRP）试剂盒（鼠）说明书

One Step Western Kit HRP（Mouse）

目录号：  K2030     

保   存：  2 - 8  ℃，避免冷冻

组分说明

Cat. No.                  K2030        K2030A      K2030B

Kit Size                    10           2            50

封闭液                   125 ml        30 ml        500 ml

抗体反应液 HRP（鼠）    1 ml          200  μl      5×1 ml

抗体稀释液               125 ml        30 ml        500 ml

漂洗液（10×）           125 ml        30 ml        500 ml

产品简介

      一步法快速WB 试剂盒（鼠）是上海研谨生物新的Western  Blot 检测试剂盒，能够在1 小时左右得到高质量的 Western Blot 结果，且操作简便、检测灵敏度高、背景低、不需再加入二抗、系统稳定性强。常规的Western Blot 间接 法检测过程（封闭、一抗结合和二抗结合）需要较长的时间，实验流程复杂且需要多步条件优化。胶上的蛋白转移到载体膜上后，使用试剂盒中的封闭液孵育5 min，再用抗体反应液处理后的一抗孵育载体膜，经洗涤三次（每次5 分钟）后，即可进行发光或显色检测。本试剂盒针对目的蛋白一抗为鼠来源的实验系统使用。

注意事项

 1.  客户自己准备鼠来源的一抗。

 2.  使用封闭液、抗体稀释液（鼠）、漂洗液之前请充分混匀。

 3.  漂洗液如在2-8  ℃保存时出现沉淀，请恢复到室温，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室温保存一个月。

 4.  建议转膜完成后用丽春红等试剂染色，并把膜上多余部分剪去以增加试剂的使用效率。

 5.  一抗和抗体反应液HRP（鼠）需要通过预实验来确定最佳的稀释用量。

 6.  抗体反应液HRP（鼠）、抗体稀释液和抗体用量可根据膜的大小按比例放大或减少。

 7.  加入一抗的抗体稀释液可以回收重复使用一次。特异性及亲和力不好的抗体建议不重复回收使用。回收后抗体如在1-2天内使用放置在2-8  ℃，长期保存请在-20℃冻存，避免多次反复冻融。

 8.  如果存在较高背景的情况，请调整抗体的用量，并增加洗膜次数。

 9.  试剂盒内所有试剂请于2-8  ℃保存，避免冻融。

 操作步骤

 本产品适用于转膜完成后的封闭及抗体孵育步骤，以5 cm×8 cm 膜为例：

 1.  漂洗液准备：取10 ml 10×漂洗液用蒸馏水稀释至100 ml，待用。每次洗膜用8-10 ml。

 2.  转膜完成后，将膜浸没到10 ml封闭液中，室温封闭5分钟。

 3.  倒掉封闭液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于摇床上用较大速度漂洗1分钟。

  4.  洗膜的同时可准备抗体孵育液：取抗体反应液HRP（鼠）100μl到EP管中，加入鼠源一抗3-10μg，枪头吸打至充分混匀，室温孵育5分钟。

  5.  将混匀的抗体与反应液HRP（鼠）混合液加入到10 ml  抗体稀释液中，充分混匀。

 注意：1）一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，取100μl抗体反应液HRP（鼠）到EP管中，加入10μl一抗，加入到10 ml  抗体稀释液中，充分混匀，室温孵育5分钟。

2）如果膜面积较小，可按比例减少抗体、反应液及稀释液的用量。

6.  步骤3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，将一抗、反应液及稀释液混合而成的抗体孵育液加到膜上（确保孵育液*浸没膜表面），在摇床上以适当速度室温孵育40分钟。

7.  弃去（回收）抗体稀释液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分钟。

8.  进行后续检测。建议采用ECL或者沉淀型TMB法进行检测。

应用实例

A:  普通WB对照：beta-actin鼠单抗（K0096）5ug室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

 （K0102）1：10000稀释，室温40min，ECL（K0049）曝光

 B:  一步法WB： beta-actin鼠单抗（K0096）5ug 室温孵育40min ，ECL（K0049）曝光

 实例一  抗原为         293T 细胞全裂解液（K0065） 

 C：普通 WB 对照：GST 鼠单抗（K0084）2.5ug 室温孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

 （K0102）1：10000 稀释，室温40min，ECL（K0049）曝光。

 D：一步法WB：  GST 鼠单抗（K0084）2.5ug  室温孵育40min ，ECL（K0049）曝光。

 实例二  抗原为         E.coli 多标签蛋白裂解液（K2016） 

 常见问题及解决办法  

 问题：信号太弱或者看不到条带                                                      

可能原因：

a蛋白上样量太少

b蛋白转膜效率太低

c一抗亲和力较低

解决方案：  

A 进行SDS-PAGE电泳时加大上样量。

B 优化转膜时间或者电流，确保转膜时膜与胶之间没有气泡。  

C 增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育时间。 增加抗体浓度可以增加信号。

D 对于低亲和力抗体来说，减少洗膜时间可以增加信号。由每次10min，减少到每次5min     可以增加信号。  

问题：背景偏高

可能原因：

a 一抗使用过量                      

b一抗有非特异性结合或者与封闭试剂有交叉反应     

c洗膜时间太短

d曝光显影时间过长

e容器或者试剂被污染

解决方案：

A  减少一抗的使用量，相应的减少WB-1用量。

B  使用 pretreat A-b（M01052）。客户还可以使用 Quick Block Optimization kit 来找到最jia的封闭试剂。

C  增加洗涤的步骤可以进一步的降低背景。

D  减少曝光时间。如果信号和背景都高，可以等待一段时间，等背景信号减弱后，再进行  曝光。

E  每次洗涤的时候使用清洁的容器。带手套，使用清洁的镊子处理膜。

实验代做服务：