1.菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出来活化的话属于第几代？

答：保存的是第三代复活出来后，如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代，就是第四代，如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上，这一支斜面一直就是第三代，如果转接到另一支斜面就是第四代。传代原则，菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代。

2.菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗？

答：不一定非挑单菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是说从同一个菌落纯化出来的，以保证它们的特性一致。原则是尽量多挑，宁多勿少。

3.菌株冷冻保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么？

答：有标准。《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准，大家可以学习一下，各个保存方式都有介绍，但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。GB4789.28-2013建议长期冷冻储存是在不高于-70℃条件下。

4.怎样延长菌株的保存时间呢？

答：大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是很好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。例如甘油冻存管，在-80℃保存时间大于在-20℃。冻干菌粉在-20℃保存时间会比2~8℃长。

5.怎样纯化菌株？

答：纯化就是从可疑菌落平板上挑取单菌落再划线到合适的非选择性平板（如TSA、NA等）上，分离出单菌落的过程。

6. 我们只保存第一代菌株是不是要重新传代保存呢，认证老师会不会认为这是个错误？

答：一般情况下认证老师不会提出这种问题。最佳储存方式应该是，制备第一代菌株的甘油冻存管，置于超低温冰箱进行长期保存。第二代菌株作为工作储备菌株，进行斜面保存。使用第二代工作储备菌株进行转接后为第三代工作菌株。

7. 为何要将第三代作为工作菌株？

答：菌株在多次传代后，菌株的变异概率会大大增加，因此菌株传代需控制在五代以内，而第一代菌株通常相对不稳定，需传至第三代使菌株稳定。因此实际工作中通常选择第三代菌株作为工作菌株。

8. 质控菌株是不是传代超过五代就必须销毁处理？

答：不一定。传代超过五代只是存在菌种变异可能，但如果传代到第六代、第七代……经过形态、生化特性、DNA特征等验证，性状保持稳定，那么这些五代后的菌还是可以正常使用。

9.菌种编号意义？

答：以金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003为例，CMCC为中国医学菌种保藏中心缩写，其它常见菌种保藏中心还包括ATCC（美国标准菌种收藏所）、CICC（工业微生物菌种保藏中心）、FSCC（食品安全菌种保藏中心）；B的意思是细菌，对应还有F（真菌）；26003为CMCC的保藏编号。

10.同样是金黄色葡萄球菌，ATCC6538与ATCC25923有什么不同？

答：ATCC6538与ATCC25923均为来自美国标准菌种收藏所（ATCC）的菌株，不同的编号表明这两株最初始的分离来源不同。但不同的编号的生化特性是否一样，需要进行具体分析。比如在实际生物学检验中发现金黄色葡萄球菌ATCC6538溶血能力较ATCC25923要强。

11. 使用瓷珠保藏管保存菌株，加入菌液摇匀后为什么要吸干菌液？

答：瓷珠保存的原理为瓷珠为多孔结构，细菌吸附在瓷珠上，除去液体，则避免反复冻融时，液体冷冻过程中形成的冰晶损伤细菌，从而达到保护细菌的作用。如果不吸干菌液的话，那么瓷珠保存就达不到可以进行反复冻融的效果。

12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里吗？

答：一般细菌的TSA斜面，2-8℃保存，即冷藏，但弧菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌等对低温较敏感菌株，短期置于室温20-25℃保存，长期保存需使用甘油管或者瓷珠冻存。

13.复苏冻干菌株是否可以采用液体培养基？

答：可以，但使用液体复苏的话只能观察到培养基混浊，无法确定是否有污染。建议使用平板培养基复苏冻干菌株，有助于简单通过肉眼观察菌落形态以分辨复苏出来菌株是否存在污染，初步鉴定菌株纯度。

14.复苏冻干菌株是否可以采用显色培养基？

答：不建议采用显色培养基复苏冻干菌株。冻干菌株在冻干过程中会受到一定的损伤，复苏需要一个最适生长环境，故复苏培养基不能选用含有抑菌成分不利于菌株复苏的这类选择性培养基（显色培养基属于选择性培养基）。

15.产气荚膜梭菌做冻存时是否需要保持厌氧状态？

答：不需要。产气荚膜梭菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度要求并不太严格，按照一般菌株冻存方法进行冻存即可。如果是冻存严格厌氧菌，则需特殊的冻存方法。