小儿眼病的病情准确诊断与监测直是临床上的大难题，往往需要通过临床症状来评判。因此，小儿眼病的诊断评估急需新的分子诊断技术的帮助。房水是眼球眼房中，介于角膜和晶状体之间的无色透明水样液体，主要作用为屈光、为眼内组织提供营养和氧气、排出其代谢产物和维持眼内压。使用前房穿刺术可以安全地取出房水，作为液体活检样本用于诊断和监测眼病。

研究表明，外泌体在视觉系统中可能有重要作用，如外泌体与青光眼和黄斑变性的病理生理相关。由于血-视网膜屏障存在，房水中的外泌体主要由眼内组织分泌，使得外泌体在眼病研究中更具有针对性。前的研究中并未涉及房水外泌体的来源与分布，且由于技术手段的限制，至今尚未将房水外泌体与小儿眼病联系起来。

基于以上研究成果与客观需要，研究组获取了患有不同眼病，包含天性白内障（CAT），天性青光眼（GLC），小儿视网膜疾病（PRD）和视网膜母细胞瘤（Rb）的19个不同患者的房水样本，再将Rb患者根据治疗情况分为经过初步治疗（诊断+初步切除）（Rb_Tn）和经过主动治疗（二次切除+化疗）（Rb_Tx）两组，使用全自动外泌体荧光检测分析系统 ExoView的配套芯片，通过抗原抗体结合捕获了房水中的异性外泌体，无需纯化，直接检测了房水中存在的不同亚群的外泌体的含量。

在非肿瘤眼病（CAT+GLC+PRD）和Rb_Tx组中，CD63+外泌体数量显著高于其他表型，表明房水CD63+外泌体占大多数（图1c）。Rb_Tn组的外泌体数量要高于Rb_Tx，说明在化疗前房水中可能含有大量肿瘤分泌的外泌体（图1d）。

图1 ExoView检测不同患者样本的外泌体跨膜蛋白的表达。

（a）不同眼病样本的外泌体荧光图像（红色：CD63；绿色CD81；蓝色：CD9）；（b）不同患者样本经过IgG阴性对照标准化的荧光颗粒计数表；（c）（d）不同组别样本经过IgG阴性对照标准化的荧光颗粒计数的柱形图。

对不同组别的各个外泌体亚群进行统计分析发现，非肿瘤眼病（CAT+GLC+PRD）和Rb_Tx组中，仅表达CD63的外泌体数量多，Rb_Tn组的亚群则更加多样化（图2b&图2c）； CAT/GLC/PRD/Rb_Tx组中CD63+外泌体在CD63捕获位点中比例高（图2d&图2e），而在Rb_Tn组的比例则显著小于其他组，但CD9+/CD63+，CD63+/CD81+和CD9+/CD63+/CD81+则相对更多（图2f）。以上结果说明，仅表达CD63的外泌体是房水中所有的，Rb_Tn组的其他亚群则与肿瘤相关，肿瘤的治疗改变了外泌体的亚群组成比例。

图2    ExoView检测不同组别样本的外泌体跨膜蛋白的共定位

（a）荧光图像示例（红色：CD63；绿色CD81；蓝色：CD9）；（b）（c）不同组别的各个外泌体亚群数量；（d）（e）（f）不同组别的各个外泌体亚群比例。

为确认ExoView芯片捕获的是膜结构完整的外泌体，研究人员将两份样本经Triton-X 100处理破坏外泌体膜结构后，再使用ExoView检测。与未经处理的样本对比，荧光颗粒计数有显著下降，证明实验检测到的外泌体是脂双层结构完整的外泌体（图3）。

图3  Triton-X100处理过的房水样品的跨膜蛋白表达。

在人的其他体液，如血浆和淋巴液中，CD63+外泌体占比仅为≤10%，而房水中CD63+外泌体的含量很高，说明CD63+外泌体可能是房水有的。有研究表明，鼠视网膜色素上皮分泌的CD63+外泌体参与了巨噬细胞的细胞间通信。因此，CD63+外泌体可能与眼部的免疫调节相关。Rb患者房水中表型更加多样化的外泌体来源可能是肿瘤细胞；经治疗后，CD63+外泌体比例上升，说明眼部趋向正常，因此，CD63+外泌体，以及肿瘤相关外泌体亚群的含量有作为肿瘤病情监测指标的潜力。在今后的研究中，使用ExoView检测含有更多种蛋白标志物和内容物的外泌体，可以检测并识别更多疾病相关的蛋白标志物和内容物，助力小儿眼病的诊断和治疗。

本研究中，科学家借助美国NanoView Biosciences公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测病人样本中微量的外泌体，无需纯化，操作简单。次结果直接输出外泌体粒径，对数目，蛋白表型，不同亚群的含量。多角度全·方位的佐证了外泌体或可作为液体活检样本用于诊断和监测眼病。也说明了ExoView的无需纯化，全面表征的点是临床液体活检，尤其是微量检测的大器。

为了更好的服务中国客户；Quantum Design中国子公司在北京建立了业的客户服务中心，正式推出业的全·方位外泌体表征测试服务，您只需要少量样品即可获得全·方位的外泌体表征数据：

服务推出至今，短短年时间已经助力多个单位客户发表高水平文献：

☛ 上海大学肖俊杰课题组在《Journal of extracellular vesicles》发表文章

☛  中国科学院深圳技术研究院杨慧课题组发表在《Lab on a Chip》发表文章

☛  北京天坛医院张力伟课题组、国家纳米科学中心梁兴杰课题组、北京航空航天大学陈军歌课题组在《Advanced Science》发表文章

☛  同济大学附属上海市肺科医院、上海思路迪转化医学团队在《Journal of Nanobiotechnology》发表文章

【参考文献】

[1] Peng, C. C., Im, D., Sirivolu, S., Reiser, B., Nagiel, A., Neviani, P., ... & Berry, J. L. (2022). Single vesicle analysis of aqueous humor in pediatric ocular diseases reveals eye specific CD63‐dominant subpopulations. Journal of Extracellular Biology, 1(4), e36.

相关产品

1、全自动外泌体荧光检测分析系统

https://www.chem17.com/product/detail/35508627.html

2、ExoView外泌体全面表征试剂盒

https://www.chem17.com/product/detail/36142894.html