外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，是细胞间信号传输的载体。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，参与细胞间通讯。近年来，外泌体的研究热度持续攀升，在2019年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目的总数突破500个，立项的总金额突破2亿元。但由于外泌体的尺寸（30~200 nm），常规的光学显微镜无法对其进行成像分析，因此很少有技术能够对单个外泌体进行物理表征和蛋白分型。

美国NanoView Biosciences公司推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，采用了特色的SP-IRIS成像技术，只需要少量样品即可一次完成外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位、亚群分布的分析。全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，目前在全球已近100多个实验室采用该技术，发表文献超过200篇。进入2022年，使用ExoView发表的论文出现井喷性增长，短短数月已经发表了超过94篇。本文选取了2022年的7篇在高水平期刊《Journal of Extracellular   Vesicles》发表的比较有代表性的文章，来说明ExoView在单外泌体亚群分析、血浆、光诱导、神经酰胺、3D细胞培养、心功能不全、疫苗等研究领域的具体应用。

1. 对从T淋巴母细胞和前列腺癌细胞释放的外泌体CD47、整合素和四跨膜蛋白进行单外泌体水平综合分析

CD47可调节特定编码和非编码 RNA 向外泌体的运输，并且CD47+外泌体的RNA含量与从相同细胞释放的CD63+外泌体的RNA含量不同。Sukhbir Kaur^[1]等使用ExoView对野生型、 CD47 缺陷型 Jurkat T 淋巴母细胞系和PC3前列腺癌细胞系衍生的外泌体的四跨膜蛋白、整合素和CD47进行共定位分析。结果表明在Jurkat细胞衍生的外泌体上，β1和α4整合素亚基主要与CD47和CD81实现共定位，没有与CD63和CD9实现共定位，验证了早先研究的结果。此外，PC3细胞衍生的外泌体很难检测到α4整合素，但它的CD81与β1、CD47存在特异性关联。总之，CD47+外泌体与CD63+、CD9+外泌体不同，它可通过待确认的机制间接调节携带非相互作用四跨膜蛋白的外泌体丰度。

图1 ExoView对从 野生型、CD47缺陷型Jurkat T 淋巴母细胞以及野生型、CD47 缺失型的PC3 前列腺癌细胞释放的外泌体进行无荧光标记和荧光标记分析

更多信息请了解:

[1] Sukhbir   Kaur ……& David D. Roberts. (2022) Single vesicle analysis of CD47 association with integrins and tetraspanins on extracellular vesicles released by T lymphoblast and prostate carcinoma cells. Journal of  Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12265.

2. 四跨膜蛋白区分人血清和血浆中不同的外泌体亚群-血浆样品中血小板外泌体的贡献

早期研究证明从血液中分离外泌体的能力对于将外泌体开发为疾病的生物标志物至关重要，尤其是从血浆和血清中分离外泌体，但很少有研究系统地比较这些外泌体来源的类型。Nasibeh Karimi^[2]等对确定血浆和血清中不同外泌体亚群的存在进行了研究。研究人员采集健康受试者血液，分别用K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血浆，同时用血清凝块激活剂管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和质谱等技术分析分离出的外泌体亚群。结果表明人类血液中含有多个携带不同四跨膜蛋白的外泌体亚群，使用不同的抗凝剂和离心方法，会影响外泌体亚群的分析。

图2 ExoView检测从血浆、血清、人肥大细胞系分离的外泌体的数量、共定位和粒径

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[2] Nasibeh Karimi ……& Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

3. 光诱导免疫功能外泌体的高效产生

基于外泌体的治疗方法和疫苗的不断兴起，临床应用剂量规模的研发始终是一个巨大的瓶颈。为了克服这样的障碍，Shaobo Ruan^[3]等开发了一种简单直接的方法，通过利用近紫外LED灯（365 nm）的光感应来促进树突状细胞分泌外泌体 (DEV)。体外和体内实验的结果显示，近紫外波长不会损害细胞生长，使DEV生产率提高了13倍以上，同时让DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成为理想的治疗平台。

图3 ExoView检测mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性标记物的数量、共定位以及进行荧光成像

更多信息请了解:
[3] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles,   https://doi.org/10.1002/jev2.12194.

4. 神经酰胺转运蛋白在外泌体起源和鞘脂组成中的作用

早先研究显示神经酰胺可以诱导外泌体的形成，但神经酰胺的调控机制还有待确认。Simone M. Crivelli^[4]等发现神经酰胺转运蛋白 (CERT) 在内质网 (ER) 和接触位点的多泡核内体之间介导神经酰胺的非囊泡转运，而该过程取决于CERT的PH结构域与核内体中PI4KIIα生成的PI4P的相互作用。此外，Tsg101蛋白是运输所需的内体分选复合物 (ESCRT-I) 的一部分，在携带神经酰胺的 CERT 的 START 结构域和Tsg101蛋白之间形成复合物，。结果表明，抑制神经酰胺的合成减少了CERT-Tsg101复合物的形成。CERT的过度表达会增加外泌体的分泌，而抑制CERT会减少外泌体的形成以及降低外泌体中神经酰胺和鞘磷脂的浓度。

图4  ExoView对 HPA-12治疗组和对照组的外泌体进行计数以及通过对神经酰胺标记进行荧光成像

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[4] Simone M. Crivelli ……& Erhard Bieberich. (2022) Function of ceramide transfer protein for biogenesis and sphingolipid composition of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 11:e12233.

5. 用于分离3D细胞培养衍生外泌体的快速管道

外泌体的近期细胞生物学研究显示对3D细胞培养衍生外泌体的需求不断增加，因为它被认为可以更精确地代表体内外泌体。因此，开发将外泌体从3D细胞培养物中分离出来的有效且可调控的方法变得非常迫切。Heikki   Kyykallio^[5]等使用纳米原纤维纤维素 (NFC) 支架作为3D细胞培养基质，开发了两种不同方法的管道，可用于从癌症球体中分离外泌体。其中，一种分批处理方法可以在培养期结束时提高外泌体产量，而另一种收获方法可实现外泌体的时间依赖性收集，将外泌体分析与球体开发相结合。这两种方法都易于快速设置，并且提高外泌体产量。结果表明，与在超低吸附培养板上无支架培养相比，NFC方法可进行定制化且更易于操作，从而实现外泌体的高产量。

图5 ExoView检测使用NFC的3D细胞培养衍生的外泌体，统计各捕获位点的外泌体数量以及进行荧光成像

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[5] Heikki Kyykallio ……& Pia R-M Siljander. (2022) A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12273.

6. 含miR-421的外泌体与空气污染（PM2.5）诱导心功能不全的发生机制相关

大气细颗粒物（PM2.5，空气动力学直径≤2.5 μm）是空气污染的主要原因。越来越多的证据表明，大气PM2.5浓度的升高与总死亡率呈正相关，尤其是心血管疾病和呼吸系统疾病的死亡率。   PM2.5急性/亚急性暴露对人体的危害不容忽视，但是对于呼吸系统亚急性暴露于PM2.5所诱发心脏功能不全的分子机制尚不全清楚。上海大学王红云^[6]等在大气污染相关的心血管疾病研究方面取得新进展，揭示了大气PM2.5亚急性暴露引发心功能不全的新的分子机制：大气PM2.5亚急性暴露在肺损伤后促进外泌体释放其携带的miR-421，通过抑制ACE2导致   PM2.5诱导的心功能不全。

图6  ExoView检测从暴露于PM2.5的细胞上清液提取的外泌体和对照组外泌体的计数、粒径以及进行荧光成像

更多信息请了解:

[6] Hongyun Wang ……& Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppresses air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signalling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.

7. 基于细菌外泌体的新型疫苗对疾病的保护作用

自从新冠疫情爆发以来，有多种不同技术路线的疫苗在抗疫中发挥了重大作用。然而现有的疫苗有诸如稳定性、保存、反应速率、产量等问题，而且病毒变种如Delta的流行，进一步降低了疫苗的保护效率，需要疫苗技术的突破来克服。Jiang和Driedonks^[7]等通过在细菌的外泌体表面修饰病毒S蛋白的受体结合结构域（RBD）制成了新型疫苗。革兰氏阴性菌能够产生外膜囊泡（OMV），在哺乳动物体内具有免疫刺激作用，诱导炎症发生并激活树突细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞，而经过改造的工程菌能够产生降低了内毒性的OMV。

图7 ExoView对RBD-OMV组以及对照组的外泌体的表型进行无荧光标记和荧光标记分析

更多信息请了解:

[7] A bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type and Delta variants.

在上述7篇文章中，科学家借助美国NanoView Biosciences公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测样本中的外泌体，无需纯化，操作简单。一次结果直接输出外泌体粒径，绝对数目，蛋白表型，不同亚群的含量、多色荧光成像图。7篇文章分别从单外泌体亚群分析、血浆、光诱导、神经酰胺、3D细胞培养、心功能不全、疫苗等研究领域介绍了ExoView的无需纯化，全面表征的特点，有力地证明ExoView是外泌体检测的一大利器。

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☛ 上海大学在《Journal of extracellular vesicles》发表文章。

☛  中国科学院深圳技术研究院在《Lab on a Chip》发表文章。

☛  北京天坛医院、国家纳米科学中心、北京航空航天大学在《Advanced Science》发表文章。

☛  同济大学附属上海市肺科医院、上海思路迪转化医学在《Journal of Nanobiotechnology》发表文章。

☛ 山东千佛山医院在《NANO LETTERS》发表文章

☛ 南京大学在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》发表文章

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