近年来有研究发现，纳米颗粒的粗糙度对其性质和功能有显著的影响，清晰的理解表面粗糙度对外部刺激的反应和相互作用，可以为预测纳米颗粒在递送、分布等现象中的行为提供可靠信息。因此获得表面粗糙度信息对材料性能的研究具有重要的意义。目前，常通过光学显微镜和原子力显微镜测量这种特性，但光学显微镜仅能在毫米尺度上定位纳米颗粒的突起处，AFM对表面不平整样品的定位非常有挑战性。

美国Quantum Design公司推出的AFM/SEM二合一显微镜FusionScope，将SEM、AFM以及EDS等多种技术深度融合，通过共享坐标系，可提供AFM-SEM-EDS三位一体的原位相关解决方案，轻松揭示来自同一目标区域的不同特性。其中样品台可以实现-10°-80°旋转，为探针提供侧向视野，可视化记录探针在样品表面扫描的动态过程，排除一切不确定因素，为测试结果提供最直接的证据。

基于此，美国Quantum Design公司利用AFM/SEM二合一显微镜FusionScope对表面形貌极为复杂的维生素C颗粒进行了多维度、全面的研究。首先，借助FusionScope的SEM识别特定单个颗粒的能力，将悬臂尖精确引导至目标区域，同时利用侧向视野观察AFM的实时动态测量过程，最后结合SEM成像、AFM形貌测量以及力-距离曲线分析，获取了单个颗粒的形态、表面粗糙度信息以及探针尖被颗粒污染的可能性，为增强颗粒研究和分析方法奠定了基础。

本实验中，研究者采用3.5kV低加速电压，以消除SEM在扫描维生素C有机颗粒时产生的电荷积累。FusionScope的SEM功能可以轻松识别和定位目标维生素C颗粒（图1a），可视化提供悬臂尖运动的实时状态，自动将AFM尖精准导航至目标区域，侧向视野可以直观的观察悬臂尖，确保尖处于颗粒的预期位置（图1b）。随后，在调幅模式下进行高分辨率AFM成像（图1c）。观测所得的SEM和AFM数据都可以在FusionScope软件中相关联，使数据分析变得简单明了（图1d）。

图1：通过FusionScope获得SEM与AFM叠加图像的流程，(a)分辨目标维生素C颗粒；（b）通过侧向视野AFM探针置于目标颗粒上方；（c）扫描得到颗粒的高分辨AFM图像；(d)将两个通道叠加。

为了对维生素c颗粒进行全表征，本工作中重点分析了3种不同形状和大小的颗粒，以评估它们的表面粗糙程度。图2中显示了3个单独颗粒的SEM正视图，可以清晰分辨三组样品的大小和结构。

图2：SEM 顶部视野中的三种不同形貌的维生素C颗粒。

利用FusionScope的共享坐标系，研究者将AFM尖无缝导航到每个独立的颗粒表面。样品和探针尖的近正交视角进一步促进了精确定位，特别是接近具有精细结构的样品时，如颗粒3。

图3：SEM侧向视野中探针尖靠近3组样品表面。

图4：振幅模式下记录的AFM形貌扫描图，3组颗粒的结果显示如图，蓝色框中显示的是粗糙度测量范围，粗糙度的结果从~600 nm（颗粒1），到420 nm（颗粒2），再到150 nm（颗粒3）不等。

图5：(Top)高分辨的AFM形貌和相位图像显示出颗粒2的可能组成成分。（Middle）AFM形貌与相图的叠加图案揭示在同一个结构处二者具有不同的成分（Bottom）在ROS1和ROS2两处的力曲线揭示材料具有不同的刚度和粘附性能。

该样品所有的力-距离曲线测试包括当悬臂梁接近样品表面（图6（1））至与样品接触（2），到悬臂梁将颗粒向下推到底部（3），最后对颗粒进行真正的机械力探测，都是用SEM 在侧向视野中观察到的。红色曲线表示的探针偏折其实是一种假象，将力-距离测量与SEM侧向视野相结合，能够避免这些误导性的结果，并提供微小物体表面的力学性能的分析。

侧向视野中观察到的倾斜样品力学曲线测量动态过程

图6：SEM图像显示了在获取力-距离曲线时悬臂梁的位置，为了说明纳米颗粒在力-距离曲线中的运动，在SEM 图像中添加了水平虚线后，将其分成了三个阶段并获得力曲线（a-c）。图6（1）和图6（2）之间的力-距离曲线显示悬臂在接触颗粒之前的恒定偏折；另一方面，在图6（2）-（3）之间显示了偏折量的增加，该变化是由于探针将颗粒向下推到了表面；最后绿色曲线所示陡峭的力增长是由于纳米颗粒定格至底部，完整的力曲线如图6d所示。