核酸中的蛋白质污染难以识别？别怕，这个方法事半功倍
时间：2023-07-24 阅读：628
核酸中的蛋白质污染鉴定难度大
苯酚-氯仿法是核酸提取的经典方法，却极易在回收水相中的核酸时引入蛋白污染。这将导致：
1 A260读数偏高（核酸在260nm处有吸收），计算核酸浓度偏大；
2 污染蛋白通过抑制或干扰酶促反应，影响下游的RT-PCR及qPCR结果，但是由于蛋白质的消光系数远小于核酸的消光系数(蛋白中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半 胱氨酸的二硫键在280nm处有吸收)，因此需要蛋白质浓度达到较高的水平才能在A260/A280的比值上体现出来(Glasel,1995,Hubeman,1995,and Manchester,1995)1-3，这给核酸中的蛋白质污染鉴定带来很大难度。
解决方案
针对这一难点，NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight超微量分光光度计内置了Acclaro智能污染物分析系统，能够基于光谱数据库和算法准确识别、鉴定出待测样品中的污染物质，并实时给出校正后样品真实浓度（见下图1）。今天我们通过实验解析蛋白污染对核酸样品纯度、定量的影响，以及NanoDrop One是如何准确识别此类污染，并给与准确校正的。
下图1 Acclaro智能污染物识别功能提示
样品中可能存在的污染物
1a) 检测结束之后，在浓度前会显示黄色三角形，提示在此dsDNA样本中检测到污染物
1b) 吸光度光谱图中，蓝色表示原始光谱(DNA加污染物)、绿色表示修正后光谱(DNA减污染物)、黄色标识污染物光谱，右上角给出包括校正前后的样品浓度A260/A280、A260/A230比值和存在的污染物及类型
实验过程
将dsDNA标准品（鲑鱼精子DNA溶液）和蛋白样品（BSA溶液）按照不同比例混合得到九组混合物（见表1）。使用NanoDrop One分别测量九组混合物dsDNA浓度，每组溶液均重复测量五次，计算平均浓度和标准偏差(SD)（结果见表2）。
表1 不同量的DNA 和蛋白原液混合比例
表2 NanoDrop One 测量混合物中DNA浓度
表2中，The original（uncorrected）DNA 浓度是NanoDrop One直接测出的数据，The corrected DNA浓度（混合物5–9）是NanoDrop One Acclaro软件分析并校正后的数据。（注：混合物1-4由于污染蛋白浓度过低，不足以触发Acclaro软件的分析校正功能，因此使用Thermo Scientific™ TQ Analyst™ software package来做光谱分析完成数据校正。)
实验结果
观察该表中original DNA浓度数值及纯度比值，可以看出蛋白污染对核酸样品浓度的影响规律：
1 不同程度的蛋白污染，都会导致核酸浓度虚高。且污染蛋白含量越高，核酸的测量值和真实值偏差越大。
2 足够高的蛋白含量才能够引起260/280纯度比值的显著变化。本例中污染蛋白比例占到近72%时，A260/A280纯度比值为1.74，仍处于可接受范围内。当污染水平从72%增加到98%时，A260/A280纯度比值才从1.74稳步降至0.89。
同时，从该表中corrected DNA浓度以及黄色警示标识表示可以看出NanoDrop One的污染物校正功能特点：
1 能够准确识别并且定量核酸样品中的蛋白污染，超出一般实验可接受范围时给与警示符号提示。
2 使用Acclaro软件，校正后的核酸浓度与真实值的偏差控制在10%范围内。即使对于98%的蛋白污染浓度，Acclaro给出的校准值依然在此范围内，且具有高度可重复性。
表3 所有混合物的校正浓度均在实际DNA浓度的10％以内
NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight内置的Acclaro智能污染物分析系统提供了一种全新的计量学方法，帮助研究人员：
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确定样本中的污染物类型；
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确定污染物浓度；
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获得校正后的核酸浓度；
极大的降低了核酸质控的难度，节约了时间成本、减少了耗材浪费。
基因有限公司简介
基因有限公司作为Thermo的忠实合作伙伴，在国内推广NanoDrop产品线近20年，在全国19个大中城市设有办事处或者联络点，接下来也将会一如既往地继续为广大客户提供包括NanoDrop在内的产品售前咨询、售后支持和仪器维护维修等优质服务。
参考文献
1. Glasel, J.A. 1995. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques 18:62–63.
2. Huberman, J.A. 1995. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 nm and 280 nm.Biotechniques 18:636.
3. Manchester, K.L. 1995. Value of A260/A280 Ratios for the Measurement of Purity of Nucleic Acids. Biotechniques 19:208-210.