布鲁氏菌病检测技术

1.概况
        布鲁氏菌病（简称布病），是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患的传染病。临床主要特征是母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织（如睾丸、关节）的炎症。人类感染布病后，病程长，反复发作，长期不愈。布病几乎遍及世界各地。凡有牲畜的地区都有布病流行。据不*统计，在160个国家和地区中就有123个国家和地区有布病发生。我国多见于内蒙古、东北，西北等牧区。在北方农区也有散发，常呈地地方性流行。
　　在不良环境，如抗生素的影响下，本菌易发生变异，通常变异形成的布鲁氏菌可在机体内长期存在。该菌对热抵抗力不强，63℃经7～10 min可被杀死，在鲜乳中可存活2天到18个月，在冻肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎儿体内可分别存活37天和6个月。对常用消毒药敏感，如0.1％升汞数分钟，1％来苏儿或2％福尔马林15 min可将其杀死。日光下曝晒4 h可杀死本菌。
　　人和多种动物对布鲁氏菌易感。动物中羊、牛、猪的易感性zui强。母畜比公畜，成年畜比幼年畜发病多。在母畜中，*次妊娠母畜发病较多。带菌动物，尤其是病畜、流产胎儿、胎衣是主要传染源。消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途径，也可通过损伤的皮肤、粘膜等感染。常呈地方性流行。人主要通过皮肤、粘膜和呼吸道感染。
        本病一年四季均可发病。流行区在发病高峰季节（春末夏初）可呈点状暴发流行。患病与职业有密切关系，如：兽医、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工  等感染机会较高。
       人类布鲁氏菌病的预防，首先要注意职业性感染，凡在动物养殖区、屠宰区、畜产品加工厂的工作者以及兽医、实验室工作人员等，必须严守防护制度（即穿着防护服装，做好消毒工作），尤其在仔畜大批生产季节。更要特别注意。病畜乳肉食品必须灭菌后食用。必要时可用疫苗接种，接种前应行变态反应试验。阴性反应者才能接种。

2.实验室监测技术概述（据布鲁氏菌病防治技术规范）
2.1检测方法 血清学实验或细菌分离。初筛试验选用虎红平板凝集试验（RBPT）或乳牛布病全乳环状试验（MRT）（见GB/T 18646）。正式试验选用动物布病试管凝集试验（SAT）或动物布病补体结合试验（CFT）（见GB/T 18646）
2.2监测对象：牛、羊、猪、鹿等动物。
2.3监测方法：采用流行病学调查、血清学方法，结合细菌分离进行监测。
2.4监测范围、数量
         免疫地区：对新生畜、未免疫畜、免疫一年半或口服免疫一年以后的牲畜进行监测（猪可在口服免疫半年后进行）。监测至少每年进行一次，牧区县抽检500头（只）以上，农区和半农半牧区抽检200头（只）以上，交通不便的边远地区抽检3个乡9个村50%的牲畜进行血清学监测。
         非免疫地区：监测至少每年进行一次。达到控制标准的牧区县抽检1000头（只）以上，农区和半农半牧区抽检500头（只）以上；达到稳定控制标准的牧区县抽检500头（只）以上，农区和半农半牧区抽检200头（只）以上。
         所有的奶牛、奶山羊和种畜每年必须进行两次血清学监测。
2.5监测时间
        对成年动物监测时，猪、羊在5月龄以上，牛在8月龄以上，怀孕动物则在第1胎产后半个月至1个月间进行；对S2、M5、S19菌苗免疫接种过的动物，在接种后18个月（猪接种后6个月）进行。
2.6监测结果的判定与报告
        初筛试验出现阳性反应，并有流行病学史和临床症状或分离出布鲁氏菌，判为病畜。
        血清学正式试验中试管凝集试验阳性或补体结合试验阳性，判为阳性畜。
        判定时应注意排除其它疑似疾病和菌苗接种引起的血清学反应。
        按要求使用和填写监测结果报告，并及时上报。
        疫情处理必须严格执行《牛结核病防治技术规范》的有关要求。

3.实验室检测方法 
        实验室检测包括以下几种方法：
3.1细菌学检测
        将样品剪成小块，用镊子夹住直接涂抹在肝汤琼脂平板上，一式两份，一份放10%二氧化碳中培养，一份在普通环境中培养，一般37℃培养10天，布氏杆菌菌落在上述琼脂板上呈无色、透明、圆形、隆起、表面光滑、均质样的菌落、菌落中央有时有很小的颗粒，菌落开始微透明，以后逐渐变为混浊，菌落大小不等。挑取菌落涂片镜检即可发现布氏杆菌。
        用母畜流产的胎儿组织和胎衣涂片镜检也能检测到布氏杆菌。
3.2凝集反应试验 
3.2.1方法
       目前对于布病的诊断多采用凝集反应试验，主要检测血清或乳中的抗布鲁氏菌抗体。常用的监测方法有虎红平板凝集试验、布病试管凝集试验、全乳环状试验、补体结合试验。虎红平板凝集试验和全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。
3.2.2病料
3.2.2.1   虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验的病料为血清，即按常规方法采血分离制备的血清，血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血，无腐败气味。
3.2.2.2   乳牛布病全乳环状试验的病料为新鲜、洁净的全乳，采样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。
3.2.3操作步骤 （仅介绍常用的虎红平板凝集试验和试管凝集试验）
3.2.3.1虎红平板凝集试验主要的操作过程：
3.2.3.1.1  标准阴、阳性血清对照试验
        分别吸取阳性血清和阴性血清各0.03ml，分别滴于玻璃板上，在阳、阴性血清旁滴各加0.03ml抗原，用牙签搅动血清和抗原，使之充分混合， 2min时判断结果，阳性血清有凝集现象；阴性血清无凝集现象，呈均匀粉红色。
3.2.3.1.2  检测样品
        分别吸取待检血清各0.03ml，滴于玻璃板上，在待检血清旁各滴加0.03ml抗原，用牙签搅动血清和抗原，使之充分混合，2min时判断结果 。
3.2.3.1.3  结果判定方法和依据:
        在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定；受检血清4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（-）。
3.2.3.2试管凝集试验主要的操作过程：
3.2.3.2.1  受检血清的稀释度：一般情况，牛、马和骆驼用1：50，1：100，1：200和1：400四个稀释度。大规模检疫时也可只用两个稀释度即牛、马和骆驼为1：50和1：100；猪、山羊、绵羊和狗为1：25和1：50。
3.2.3.2.2  稀释血清（以羊、猪为例）和加入抗原的方法：
        每份血清用5支小试管（口径8-10mm），*管加入2.3ml石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四和第五管各加入0.5ml。用1ml吸管吸取受检血清0.2ml，加入*管中，并混合均匀。混合方法：是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿管壁吹入原试管中，如此吸入、吸出三、四次。混匀后，以该吸管吸取混合液分别加入第二管和第三管，每管0.5ml。以该吸管将第三管的混合液混匀（方法同前）吸取0.5ml加入第四管混合后，又从第四管吸出0.5ml加入第五管，第五管混匀完毕弃去0.5ml。如此稀释之后从第二管起血清稀释度分别为1：12.5，1：25，1：50和1：100。
        血清规定用0.5%石炭酸生理盐水稀释，但检验羊血清时用0.5%石炭酸10%盐水溶液稀释。
        加入抗原的方法：先以0.5%石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释（如果血清用0.5%石炭酸，10%盐水溶液稀释则抗原原液亦须用0.5%石炭酸，10%盐水溶液稀释）然后加入上述各管（*管不加，留作血清蛋白凝集对照），每管0.5ml，振摇均匀，加入抗原后，第二管至第五管各管混合液的溶积均为1ml，血清稀释度从第三管起依次变为1：25，1：50，1：100和1：200。
        牛、马和骆驼血清稀释和加抗原法，具体方法与上述的是一致的，不同的是，*管加2.4ml0.5%石炭酸生理盐水和0.1ml受检血清，加抗原以后从第二管到五管血清稀释度为1：50、1：100、1：200和1：400。
3.2.3.2.3  对照管的制作：
        每次试验须作三种对照各一份。
        阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。
        阳性血清对照：阳性血清对照须稀释到其原有滴度，加抗原的方法与受检血清相同。
        抗原对照（了解抗原是否有自凝现象）：加1：20抗原稀释液0.5ml于试管中，再加0.5ml0.5%石炭酸生理盐水（如果血清用0.5%石炭酸，10%盐水溶液稀释则也加入0.5%石炭酸，10%盐水溶液）。
3.2.3.2.4  比浊管的制作：
       每次试验须配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据，配制方法如下：取本次试验用的抗原稀释液（即抗原原液20倍稀释液）5—10ml加入等量的0.5%石炭酸生理盐水（如果血清用0.5%石炭酸，10%盐水溶液稀释则加入0.5%石炭酸，10%盐
水溶液）作对倍稀释，然后按下表配制比浊管。