1）ELISA试剂盒SCI文章将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，ELISA试剂盒SCI文章就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。 
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 "夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等）时，应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的a 决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBs Ag 有adr、adw、ayr 、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为IgM 型，能和多种动物IgG 的Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab’）或Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc 段，从而消除RF 的干扰。双抗体夹心法ELISA 试剂是否受RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 
ELISA试剂盒SCI文章双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。