获得Western Blot实验结果的方法
时间：2021-01-29 阅读：2096
蛋白质免疫印迹杂交实验（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻译指导蛋白质合成量分析检测手段中经典和广泛为业界认可的一种,也是论文中常见的数据呈现形式之一。虽然Western Blot实验原理比较简单，但是实验耗时长、步骤繁琐和实验结果重复性差，导致刚进实验室的小伙伴们，实验做的焦头烂额。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot实验结果呢，请小伙伴们跟随星博士的脚步，了解Western Blot实验的相关知识，let's go！
Western Blotting实验步骤：
- 样品制备
样本制备是决定蛋白质免疫印迹是否成功的关键步骤之一。样本必须进行研磨、匀浆、超声处理。膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还需要注意的一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷为大家提供强、中、弱三种RIPA裂解液，以及适用于各种类型的蛋白酶抑制剂。
- 电泳分离
准备好样品后，第二步就是上样和电泳分离了，上样之前小伙伴们要做的必要步骤是确定蛋白质浓度，根据蛋白质浓度确定上样量。星博士给大家推荐BCA和Bradford两款蛋白浓度测定试剂盒，小伙伴们可以根据自己的实验需求自行选择。
测完了蛋白质浓度，接下来就是上样了。首先要制备凝胶，选用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（EC0003），简单省时。然后安装电泳槽，将胶片安置在电泳槽中，在电泳装置中加入SDS-PAGE电泳液。思科捷提供10×的电泳液，稀释后直接使用，方便快捷。
上样结束后，设置电泳程序一般浓缩胶80V，分离胶120V，电泳时间一般为1-2小时，根据溴酚蓝指示位置选择停止电泳时间即可。
- 转膜
针对特定分子量大小靶蛋白而选择适当转膜条件（转膜时间，转膜缓冲液和必要低温环境）能够将 SDS-PAGE 胶上蛋白样品尽可能*转移到印迹膜上，同时减少蛋白不必要的降解，这对于终获得清晰、可信结果也是需要考虑因素。转膜方式主要包括湿式电印迹法（转膜方法）、半干式电印迹（可选的替代转膜方法）以及干式电印迹（有限灵敏度的转膜方法）。根据实验室习惯和需求，小伙伴们可以自行选择转膜方式。
膜的选择
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定，从而影响终结果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白选择0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。常见的膜有NC膜和PVDF膜，区别如下：
NC膜 | PVDF膜 | |
灵敏度和分辨率 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 较高 |
结合能力 | 80-110ug/cm2 | 125-200ug/cm2 |
材料质地 | 干的NC膜易脆 | 机械强度高 |
溶剂耐受性 | 无 | 有 |
操作程序 | 缓冲液润湿，避免气泡 | 使用* %甲醇润湿 |
检测方式 | ECL检测 | ECL检测 |
价格 | 较便宜 | 较贵 |
转膜方式的选择
湿转：
通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所研究的两个蛋白分子量差异比较大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
湿转 | |
优点 | 缺点 |
转膜条件灵活容易进行调整 | Buffer加热可能干扰转印 |
多种Buffer可用于优化转印 | 在转印的时候需要制冷装置 |
可以延长转印时间 | 需要大量的转膜缓冲液 |
可用于定量Western Blot | |
半干转：
对于半干转来说，也需要进行堆叠组装（滤纸，胶，膜需要放在转印buffer中进行预平衡）放在装置电极板的底部，盖上上极板，高强的电流通过三明治结构，转印速度较快，一般小于1h。
半干转 | |
优点 | 缺点 |
转膜速度快 | 低分子量蛋白容易转过 |
用不连续的Buffer系统优化转印的蛋白 | 对于分子量＞120KDa的蛋白，转印较困难 |
转膜缓冲液用量少 | 转膜过程容易干胶 |
容易安装 | 对于定量的Western实验不推荐使用 |
对于同一蛋白的多张膜的分析比较有益 | |
需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。针对刚建的实验室平台或者一些新蛋白的研究，经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。