随着发酵剂的商业 化 生 产 和 应 用 的 迅 速 增 加 ,工业发酵的基本目标自然转向了以小的代价获得大的产值和利润, 而实现这一目标的工程手段是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。 因此,进行工业化生产, 大规模培养非遗传修饰菌和工程菌的技术和工艺就显得日趋重要。 高密度培养技术( HCDC, high cell density culture) 就是满足这一需要而发展起来的一门新兴技术。 它不仅是生产高质量的浓缩型菌体和代谢产物的重要环节, 是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素, 也是菌体和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
1.高密度培养概述
高密度培养没有确切的定义, 是一个相对概念,指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度,使菌体密度较普通培养有显著的提高, zui终提高特定产物的比生产率。 用以描述的单位是干细胞重量/升 ( DCW/ L) 。 广 义 来 讲 , 凡 是 细 胞 密 度 比 较 高 ,以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养, 一般认为其上限值为 150～ 200g ( DCW/ L) , 下限值为20～ 30g ( DCW/ L) 。实际上, 由于不同菌种 ( 或者不同菌株) 之间存在较大的差异, 所以高密度培养的上限值和其下限值也均有例外。 Riesenberg 曾从理论上计算了充满整个发酵罐体积的zui高发酵菌体密度为 400g( DCW/ L) , 而 Markl H. 曾设想菌体充满 3/ 4 发酵罐体积, 其余 1/ 4 体积是培养基, 按照菌体干重为湿重的 20%～ 25%计算, zui高菌体密度达到了 160～200g ( DCW/ L) 。
为了提高菌体或代谢产物的终发酵密度, 需要优化高密度培养每一步表达方式和方法。 微生物培养过程中生长慢的原因不仅与培养方式有关, 也与所用培养基、 培养体积有直接关系。 几种细菌高密度培养的研究详见表 1。限制细菌高密度培养的主要因素是培养过程中底 物 对 菌 体 生 长 的 影 响 , 具 体 体 现 在 限 制 性 底 物( 高浓度培养基) 的抑制作用、 不稳定性和挥发性底物/ 产物对菌体生长的影响 ( 如产物的分解作用, 二氧化碳的高溶解率以及热量和氧气的需求量等) 、 代谢产物或副产物的积累甚至还有培养基粘度等。首先, 微生物培养基及培养条件在高密度培养过程中占有很重要的地位。 培养基与产量系数和比生长速率之间存在直接关系, 高浓度的培养基成分对高密度培养有一定的抑制作用; 培养条件则与发酵过程中不同菌体的生理生化特性有关。 两者都是在高密度培养过程中基本和必需的优化手段。
其次, 充足的底物是高密度培养的基础, 培养过程中可以通过流加补料等方式补充菌体所耗费的营养物质。 其中低浓度氨水是常用的底物之一, 它不仅可以作为氮源的补给还可以调节培养液的 pH。后, 由于积累的代谢物明显抑制了菌体的生长, 所以必须去除代谢副产物、 提高比生长速率。如过量的碳源导致了代谢物的积累 ( Escherichia. coli的代谢副产物是乙酸盐, Bacillus subtilis 为丙酸盐) ,反过来这些代谢产物的积累同时也抑制菌体对碳源
的利用。总之, 解决菌体浓度低的方法有很多, 但必须结合工艺过程的整体特点, 考虑才能使菌体浓度达到高密度 ( 详细论述见后) 。 培养基优化、 补料策略、 pH 值的选择以及代谢调控都是减少代谢产物形成并使菌体以大生长率达到高密度培养的有效途径。
1.3 高密度培养的优点
与常规培养相比, 高密度培养在发酵过程中有明显优势。 它可以提高菌体的发酵密度或单位体积培养液中菌体的浓度, 进而提高体积产率; 可以缩小生物反应器体积, 减少生产设备投资; 强化下游分离提取, 并在一定程度上减少废水量; 综合提高比生产率, 加速产品的商品化进程, 降低生产成本,并提高产品在市场上的竞争力。
 2.高密度培养的实现方法
用于细胞高密度培养的生物反应器类型有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器, 如透析膜反应器、 气升式反应器、 气旋式反应器与振动陶瓷瓶等。 高密度培养的途径主要有透析培养、 细胞循环培养、 补料分批培养等, 其中,后者是较为成熟和完善的技术。
2.1优化培养基
在分批培养过程中, 当培养体系中的营养成分( 包括碳源、 氮源和无机盐等) 的浓度超过某一临界值时, 微生物会为抵抗高盐浓度、 维持胞内环境而形成离子梯度。 这一过程需耗能才能完成, 其结果会明显抑制菌体生长, 降低菌体得率。 这就是分批培养过程中直接把含有营养物质的培养基加入, 而增加的浓度不能获得高菌体密度的原因, 也是高密度培养往往采用分批补料培养的原因。 因此, 选择适当的营养物质和适当浓度的营养物质是达到菌体高密度的重要途径之一。在实际培养过程中, 可以根据产生菌的特性和产品需求有效地控制基质培养基的品种和用量, 进行深入分析以获得适合菌体生长繁殖的增殖培养基。
以杆菌肽为例：培养基中初始葡萄糖耗尽后，控制葡萄糖的流加速率，使培养基中的葡萄糖浓度维持在一个稳定的浓度，使菌体比生长速率维持一定的速率， 较好的平衡菌体的初级代谢与次级代谢，可避免乙酸等副产物的大量积累， 又能满足菌体杆菌肽合成的需求。当维持葡萄糖浓度过低时，无法维持较高的生物量， 杆菌肽的合成速率低， 影响终的产量。当维持葡萄糖浓度过高时， 菌体生长旺盛、 初级代谢过强，菌体会发生“葡萄糖” 效应抑制菌体生长， 抑制次级代谢产物合成。因此维持发酵过程中合适的葡萄糖浓度可有效地减少副产物的累积， 提高杆菌肽合成效率。发酵基础料中初始葡萄糖浓度为 10g /L，当发酵液中葡萄糖浓度下降到一定浓度时，通过流加 40% 葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖的浓度为 1g /L、 2g /L、 3g /L 和 5g /L，结果使菌体的初级代谢与次级代谢达到理想平衡， 使杆菌肽发酵达到理想效果，30h 放罐效价达到 1015u /ml。
  
2.2 控制培养条件
适温度
适温度随着菌种、 培养基成分、 培养条件和菌体生长阶段变化而改变。 不同的微生物适生长温度范围存在一定的差异。 温度的变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质, 另一方面影响发酵液的物理性质。 在实际发酵过程中发酵液释放出大量的热量, 所以一般情况下实验所用的发酵罐都不需要加热, 相反需要冷却的情况多一些。 冷却的方法有两种, 一是通过冷却水热交换来降温, 也可以采用冷冻盐水进行循环式降温, 保持恒温发酵。
1. pH 值
在高密度培养过程中, pH 值的变化是菌体产酸或产碱等生化代谢反应的综合结果, 也是确定补料速率的依据, 把两者紧密结合起来可以实现高密度培养发酵过程的优化。 在响应曲面法 pH- stat 流加高密度培养模式中, 就是通过不断补料的方法, 成功调节 pH 使菌体达到了高密度。
2. 溶氧浓度 ( DO)
在高密度培养中, 溶氧浓度的高低对菌体生长、产物的合成以及产物的性质都会产生不同的影响 。随着菌体密度的增加, 单位体积培养物的摄氧率增加, 使发酵罐内溶氧水平逐渐下降, 低于临界氧浓度时就会抑制菌体生长。 为了增加发酵液的溶氧量,需要增大搅拌转速和增加空气流量。然而, 在大规模发酵过程中, 使用纯氧容易导致微生物氧中毒。 Meyer 和 Fiechter [16] 曾报道, 需氧发酵并不是溶氧越高越好。 适当的溶氧水平有利于菌体生长和产物合成, 但是溶氧太高有时会抑制产物的形成。 因此, 为了正确控制溶解氧浓度, 有必要考察每一种发酵产物的临界溶氧浓度和适溶氧浓度, 并使发酵过程保持在适溶氧浓度。 可以通过控制菌的比生长速率, 使溶氧浓度保持在比临界值略高一点的水平, 达到这一目的。
3. 氧化还原电位
氧化还原电位对专性厌氧微生物的生存有明显的影响, 过高时会导致菌体立即死亡。 分子氧对专性厌氧微生物的毒害作用是由于提高了环境的氧化还原电位。 环境中存在的还原性物质, 如抗坏血酸、H2S 和含巯基的有机物等, 可以使环境保持较低的氧化还原电位, 这时即使有分子氧存在, 专性厌氧微生物也不会死亡。
4.代谢产物的调控
代谢产物的调控是研究高密度培养的一种重要手段。 依据对生长曲线的分析, 培养中导致微生物生长停止的主要原因之一是代谢产物的积累和反馈抑制作用。 高密度培养过程中, 细胞在电子传递链和三羧酸循环代谢中都会产生乙酸及其它代谢产物。当分批培养中的细胞密度超过一定浓度时, 菌体会缓慢甚至停止生长。 这是由于发酵过程中乙酸盐等盐类对细菌的生长产生了负面影响, 抑制了蛋白质合成的代谢副产物的积累。 目前国外已有研究希望通过代谢工程改变细菌的代谢途径, 从而降低乙酸等其它代谢物的生成。
3.结论
随着市场需求的日益扩大, 高密度培养技术广泛地应用于各种微生物 ( 乳酸菌、 芽孢杆菌、 大肠杆菌等) 的生产中, 它不仅可以改进发酵工艺, 提升其现代化发酵进程, 而且对于增加单位体积培养液中菌体数量, 提高生产率, 加速微生物制剂的商品化进程, 更好地满足市场需求, 具有重要而深远的意义。