常用实验方法学

一、肝素的配制

市售肝素冻干粉是140单位/mg，1克瓶装，每瓶140,000单位。称取0.1克肝素冻干粉，加生理盐水5ml，配成2800单位/ml。取50~100μl湿润管壁，可抗凝人血3~5ml。血液不会凝固。老鼠血易凝固，所以浓一些。可以取0.1克肝素冻干粉，加3ml生理盐水溶解后，取50~100μl，可抗凝鼠血2~4ml。

肝素抗凝管的制备：取0.1克肝素冻干粉，加2.5ml生理盐水。取100μl~150μl滴入塑料或玻璃管中，湿润管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），横向转动，每隔5~10分钟转动一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2~5ml血液不凝固。

二、组织匀浆的制备

1、取组织块（0.2g~1g）zui少可到2~5mg在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内。

2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖 0.8的氯化钠溶液）或者用0.86冷生理盐水，匀浆介质或者生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量2/3的匀浆介质或者生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。

3、匀浆的方式有多种：手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎，反复冻融。

①手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6~8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

②机器匀浆：用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3~5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

③超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3~5次。

④反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上①②③的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解。反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

⑤取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可延长匀浆时间或增加冻溶次数（此步可省略）。

4、将制备好的10匀浆用普通离心机或低温低速离心机2000r/min左右离心10~15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留上清弃下面的沉淀。

根据你的实验需要，取适量上清液进行各种测定。

三、线粒体及微粒体的提取

（一）制备10的组织匀浆（制备方法见上述组织匀浆的制备1、2、3）

（二）制备线粒体：取10组织匀浆，用普通离心机或低温低速离心机以1000~2000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清液以8000~10000r/min（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物位线粒体。

（三）胞浆部分：分离线粒体后的上清液即为胞浆。

（四）制备微粒体：取分离线粒体后的上清液即胞浆，以144000g即40000r/min离心30分钟，沉淀物为微粒体。

（五）将分离的线粒体或微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混淆液，用手工匀浆或机器匀浆使线粒体会微粒体破碎，或者用somiprep150型超声发生器以振幅14微米超声处理30秒，或者用国产超声波发生仪，400安培，5秒/次，间隙10秒反复3~5次。使线粒体或微粒体破碎，待测酶活力，也可用反复冻融的方法使其破碎，但有部分酶活力会受影响。

（六）制备好的线粒体、微粒体、胞浆部分可根据您的需要分别进行各种测定。

四、线粒体的鉴定（中性红—詹纳斯绿B染色）

在两张干净载玻片*各滴2~3滴中性红—詹纳斯绿B染液，待其中的酒精蒸发*后，用牙签挑少许沉淀物均匀涂布在一张玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一张玻片的染液中，两片分别盖上盖玻片，染色5分钟，在高倍镜下观察，被染成亮绿色颗粒即线粒体。

中性红—詹纳斯绿B染色的配制：

A液：取詹纳斯绿B（Jana’s green B）饱和水溶液（溶解度5.18）3滴滴入5ml无水乙醇中，混匀。

B液：取饱和中性红（Neu—tral red）水溶液（10mg中性红溶于150ml蒸馏水中，并用黑纸包好贮冰箱）20~30滴滴入5ml无水乙醇中，混匀。

用时将A液和B液呼喝即成中性红—詹纳斯绿B染液（混合液中的燃料部稳定会在24小时内发生沉淀）。

注：1、若发现涂片上有成团的染料可将詹纳斯绿B3滴改成1滴或2滴，而将中性红20~30滴改成10~20滴。

2、本研究所线粒体制备方法较为成熟，一般不需要染色鉴定。

五、匀浆介质的制备

配制1000mlpH7.4，0.01mol/L Tris-HCI,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖，0.8氯化钠溶液。

三刘甲基氨基甲烷 Tris   分子量121.14， 乙二胺四乙酸二钠EDTA  分子量372.24，

蔗糖  分子量342.3

称取  Tris             121.4*0.01=1.21g

          EDTA-2Na       372.24*0.0001=37.23mg

          蔗糖            342.3*0.01=3.42g

          氯化钠          8克

将Tris 1.21g及EDTA·2Na 37.23mg加水500ml，再用200mmol/L HCI进行滴定至pH7.4，然后加入3.42克蔗糖，8克氯化钠，再用蒸馏水补充至1000ml，放入盐水瓶中，以9磅压力进行消毒或者微波炉消毒3~5分钟后放4℃冰箱中备用（也可用生理盐水代替匀浆介质）。

六、红细胞中SOD的抽提

1、采集手指血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50µ1[注1]，冲入盛有2～4ml的生理盐水的带刻度离心管中，2000转/分 离心3分钟。

2、用玻璃吸管吸去上清液（要吸干净），留沉淀的红细胞。

3、加入预冷的双蒸水0.2ml，混匀（使红细胞溶解）

4、加入95乙醇0.1ml，振荡30秒。

5、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置漩涡混匀器充分混匀（抽提）一分钟。

6、3500转/分 离心8分钟。

   此时液体分三层：上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。若上清有浑浊可加入少量固体NaCl后再离心5分钟，即可澄清。

记录上清液体积，取5～20µ1作SOD测定[注2]

[注1]：大、小鼠可取内眦血，用玻璃毛细管从眦部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，将血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干时温度要低于80℃），再用移液器取50µ1血，作SOD抽提。血量少时可取10～20µ1抗凝全血（做慢性动物试验，在饲养过程中可以反复取血5～6次。

[注2]：红细胞中只有铜锌SOD，没有锰SOD。

七、红细胞膜的制备

  1、原理和应用  哺乳动物细胞是生物质膜zui方便，的来源，除来源广泛以外，这种细胞还不含任何细胞器，从而可以得到一种纯净的细胞质膜。红细胞血影（ghost）膜主要是采用低渗透处理来获得的，在低渗介质中，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物包括血红蛋白成分因细胞破裂而释放出来。zui后，通过离心沉淀技术可获得纯净的红细胞膜（又称红细胞血影膜）。

2、仪器和设备：常速离心机和低温高速离心机。

3、试剂（建成生物工程研究所可订购）

（1）等渗缓冲液（本所有售）

（2）低渗缓冲液（本所有售）