[实验目的]

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术

[实验原理]

细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl₂低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp^r等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

[实验仪器与设备]

1．超净工作台 2.低温离心机

3. 恒温摇床 4. 恒温箱

5. -70℃ 6. 恒温水浴器

[实验材料]

1.氯化钙（CaCl₂） 2.胰蛋白胨

3.酵母提取物 4.氯化钠（NaCl）

5.氨苄青霉素 6.大肠杆菌DH5α

7.pUC19质粒 8. 50ml离心管

9.吸头、培养皿、锥形瓶等

附试剂的配制：

1. 0.1mol/L CaCl₂溶液

2. LB液体培养基

配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g

酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质*溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素（Amp）,用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。

[实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2．取0.5 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.（此时,OD₆₀₀<=0.5,细胞数务必<10⁸/ ml,此为实验成功的关键）.

3.将菌液转移到50 ml离心管中,冰上放置10min.

4.离心10min（4000rpm）,回收细胞.

5.倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.

6.用冰冷的0.1mol/L CaCl₂10ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。

7．0-4℃6000rpm，离心10min，回收细胞。

8．用冰冷的0.1mol/L CaCl₂2ml悬浮细胞 。（务心放冰上）

9．分装细胞，每200μl一份。此细胞为感受态细胞。

10．取200μl新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2μl（50ng）混匀，冰上放置30min。

同时做两个对照管：

受体菌对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水

质粒对照：200μl 0.1mol/L CaCl₂溶液+2μl质粒DNA溶液

11．将管放到42℃循环水浴1-2min。

12．冰浴2min.

13．每管加800μl LB液体培养基，37℃培养1h（慢摇）。

14．将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。

15．倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。

[作业]

观察在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长的菌落生长情况，并分析原因

[实验安排]

15学时

第1天下午—第2天上午：配LB培养基，接种，液体培养

第2天上午、下午：继续培养2-3h,制备感受态细胞，转化，培养12-16h

第3天上午：观察结果