清洁验证新方法—TOC法

2005年美国食品药品管理局（USFDA）指出，在医药行业使用TOC方法来检测清洁过程后的残留物是可行的。然而自1993年开始，制药行业一直以来都使用产品专属性方法（HPLC，ELISA）来检测残留物，所以如何使用TOC方法建立一个完整简便的清洁验证规程呢？制药行业的小伙伴们，也许都想要对TOC法有一个系统深入的了解。

中国2010年新版GMP要求所有制药企业需要对生产设备进行清洁验证，总有机碳TOC （Total Organic Carbon）分析是非常适用于清洁验证的分析方法。与传统的HPLC方法相比较，TOC法的灵敏度更高，对于少数不溶于水的有机化合物也能检测到。而且验证过程简单方便，无需设置其他参数。

验证概述

中药提取车间、中药制剂车间，以及共线生产多个品种的生产设备，为了保证大限度降低药品生产过程中污染及交叉污染等风险，根据GMP（2010年版）的要求，必须要制定共线生产设备清洗验证方案。由此可见清洁验证的重要性。

对容易擦拭且表面平整的设备，采用棉签擦拭法；对不易擦拭取样的设备及管路，采用淋洗法。根据设备的具体情况，确定可操作的清洗方法，要根据不同的清洗方法，通过测定微生物限度和总有机碳确定残留污染物的限度。 

设备清洗使用擦拭法进行清洗验证的，相应的残留物检查，使用棉签擦拭法进行采集检查试样，加总有机碳检查用水溶解稀释后测定总有机碳；设备清洗使用淋洗法进行清洗验证的，相应的残留物检查，采集淋洗液作为检查试样测定总有机碳。 

通过验证该分析方法的系统适用性、线性、准确度、重复性，确认该方法适合于设备清洗验证的检测要求，取样回收率验证取样方法的有效性。 

验证目的

通过TOC法的验证，确保该方法能够准确可靠地检测出共线生产设备清洗后的残留的污染物，能够符合预期的限度标准。这是每一位制药行业的同仁都需要注意的。

验证范围

适用于中药提取车间、中药制剂车间等共线生产相关设备清洗后，采集样品的TOC测定方法的验证。

所以，TOC方法进行清洁验证，在医药和生物制药行业里，到底应该怎样定义呢？

◆ 根据清洁过程而非产品简化验证方法；

◆ 快速评估清洁过程的清洁能力；

◆ 通过擦拭和淋洗取样法，优化关键清洁参数（TACT，即温度、动作、浓度与时间）；

◆ 估量坏的情形以及成分复杂的化合物，例如清洁剂；

◆ 加快产品更换速度，更好地按计划生产。

TOC法的*优势

对于TOC法来说，将有机物设为专属物质时，无论其来源是产品、清洁剂、化学品、溶剂，还是副产物及微生物污染，要判断出任何残留物质是否存在，都能够地很好完成这一任务。只要其分子结构中包含碳，就能够检测出任何的活性制药成分或者清洁用的残留物质。而检测结果必须低于目标化合物物的限度，提高了清洁验证的严格性。

TOC法已经逐渐被制药行业所接受，整个行业的清洁验证的严格性得到了显著提高，也越来越符合行业的整体要求。TOC法的普适性，为制药企业节省了时间和人力成本。科学、合理、可行的清洁验证过程，确保了药品安全生产所需要的清洁度。

TOC法学习笔记

一章　TOC基础知识

一、什么是TOC？

二、为什么在清洁验证和常规的清洁监测中使用TOC？

三、清洁验证中的TOC的应用

四、何时可使用TOC测定

五、TOC法与常用分析方法的比较

第二章　HPLC与TOC方法的对比

此处特别针对HPLC与TOC进行一下讲解：

一、TOC与HPLC法的比较

二、HPLC法的局限性

三、TOC替代HPLC

四、TOC法的优势

五、TOC来检测法规上的支持

第三章TOC分析方法的验证

一、分析方法验证的要求

二、TOC分析方法验证的前提：TOC分析仪的性能确认

三、系统适用性试验

四、分析方法验证的要点

五、TOC方法验证的具体内容

➤专属性

➤线性和范围

➤精密度和准确度

➤回收率试验

Ø  取样方法

Ø  擦拭法回收率

Ø  擦拭技术

Ø  淋洗法回收率

Ø  回收率接受程度

➤低检测限（LOD）、低定量限（LOQ）

六、TOC分析方法的注意点

一章TOC基础知识

一、什么是TOC？

TOC方法检测的原理：

总有机碳（TOC），由专门的仪器——总有机碳分析仪（以下简称TOC分析仪）来测定。TOC分析仪，是将水溶液中的总有机碳氧化为二氧化碳，并且测定其含量。利用二氧化碳与总有机碳之间碳含量的对应关系，从而对水溶液中总有机碳进行定量测定。

TOC法包括碳的氧化和检测生成的二氧化碳两个过程。现有多种氧化技术，包括光触酶氧化、化学氧化及高温灼烧等。

二、为什么在清洁验证和常规的清洁监测中使用TOC？

许多药品制造场所目前已经使用TOC作为CV和监测

➤非专属性的方法，在理论上能探测到所有含有有机碳的残留分子，容易验证。

➤通用的样品分析方法：清洁验证和确认，原材料和工厂用水

➤能分析很大范围的溶解，“不溶”及绝大部分制药厂工业中的常见化合物

➤TOC能探测到设备中意外未*清洁的有机杂技和残留物。

➤很高很好的费用节省。简单的验证方法，易于培训新使用者。

➤提高设备周转时间。

三、清洁验证中的TOC的应用

➤测定清洁剂的残量

➤与特定分析相结合来测定药的成份

➤为建立清洁程序﹐TOC被用作清洁度的一般指示

➤测定活性成份

四、何时可使用TOC测定

➤取决于残留物的类型 (清洁剂，活性成份，赋形剂)

➤被测物是否是水溶性的?

➤被测物是否含有碳?

TOC非专属性方法，TOC测定的是非确定物

➤TOC 方法可测定样品中的所有易氧化碳含量

➤TOC 方法只适用于水溶液样品

➤测定结果的单位用 ppb (ug碳/L) 和 ppm (mg碳/L) 来表示

Q：此处存在疑问，如果是酯溶性产品能否使用TOC法进行清洁验证的检测？

A：通过查找文献和查阅相关材料，TOC可以检测到在水中溶解度很低的有机物，而且准确度还可以。

五、TOC法与常用分析方法的比较

➤TOC法与HPLC法和UV/Vis分光光度法不同，属于非专属性方法，是检测所有含碳化合物，包括活性组分、辅料和清洁剂的理想方法。

➤TOC法的灵敏度可达亿分之一，而且与 HPLC法和UV/Vis分光光度法相比．具有不需摸索活性成分的检测方法和考虑样品的因素，较为省时等优点

Source: K.M.Jenkens, A.J. Vandervielen, Pharmaceutical Technology, April 1994

TOC = 活性物 + 赋形剂 + 清洁剂  + 水系统中的有机物

第二章　HPLC与TOC方法的对比

此处特别针对HPLC与TOC进行一下讲解：

一、TOC与HPLC法的比较

二、HPLC法的局限性

重要事项

➤专属性化合物实验

➤使用有机溶剂

➤基于化合物的下限计算

➤有限的化合物溶出度

➤有用终产品的放行

致命的缺点

➤HPLC灵敏度的局限性

➤每一个验证都必须有单独的SOP

➤很长的启动时间

➤长的样品分析时间

➤对CV来说，许多的功能不需要

➤要处理新的未知峰

Example：

在标准品出峰位置没有出峰。

通过清洁验证，没有问题！

1、出峰位置异常；

2、出现异常未知峰；

不能通过清洁验证，同时 FDA要求确认未知峰！确认工作繁琐。

三、TOC替代HPLC

➤HPLC比较难于使用且必须验证每一个有机化合物

➤无未知HPLC峰时才没有问题

➤TOC易于验证

➤TOC可用于设备刮擦后或用于终的漂洗水

➤TOC基于“坏情形下的TOC下限”

➤等于目标化合物用碳计量的上限浓度（不等于化合物）

➤所有有机污染物的总和必须小于下限

 （清洁验证中HPLC到TOC探测的转化，非常容易做到）

➤转换HPLC下限中已确定的目标化合物浓度的总有机碳的总和。

➤如果必须，调整清洁程序，以保证TOC低于TOC下限。

四、TOC法的优势

意味着将有机物作为专属物质，不管其来源（包括产品、清洁剂、化学品、溶剂、副产物及微生物污染），要判断出任何残留物质是否存在，采用TOC分析能够地很好完成这一任务，只要其分子结构中包含碳，就能够检测出任何的活性制药成分或者清洁用的残留物质。而检测结果必须低于目标化合物物的限度，提高了清洁验证的严格性。     

五、TOC来检测法规上的支持

➤ “然而, 不像终产品的残留物, 在清洗后我们期望无任何(或对非常敏感的分析来说非常低)清洁剂残留。”

FDA Guide to Inspections of Validation of CleaningProcesses

➤FDA在检测污染物残留的规章指南中，已经接受了TOC方法。

➤PDA技术报告29号和 49号的附录提到在新清洁过程中采用 TOC 方法并取代专属性方法

本文件采用的坏情况方法专注于清洁过程结束时可能存在的残余物（清洁剂）。但常见的做法是使用工艺中的污渍，或类似药品或感兴趣的化合物的替代品。

强烈推荐在清洁验证中采用TOC分析：

◀相对较低的初期投资以及很低的操作和维护的费用

◀使用方便，易于培训新使用者

◀*的灵敏度，能够执行低浓度的检测，相比于其它的方法成本极低并且能够检测所有含碳类的残留物质

◀快速的分析时间。

◀干扰极小

◀提高设备周转时间。

第三章TOC分析方法的验证

一、分析方法验证的要求

分析方法学验证包括线性、检测限( MD )、定量限 (COG)、准确度、精确度以及擦拭回收率。

Refrence:USP<1226>and ICHQ2(R1)

➜只有在分析方法是可靠的和可重复的时，验证才可通过。

➜USP<1226>与ICH Q2（R1）阐述了分析方法的验证程序。

二、TOC分析方法验证的前提：TOC分析仪的性能确认

➤分析仪器确认是一个过程，确保对特定测试使用分析方法是能符合目标用途的。

➤根据cGMP规定，“企业所使用的检测方法的准确度、灵敏度（检测限）、专属性和重现性（精确度）必须确立并有文件证明。”在这种情况下用TOC法进行清洁过程验证的测试之前，对分析仪器进行严格的确认就尤为重要。此方法包括由USP<1058>所建议的安装确认、运行确认和性能确认（IQ/OQ/PQ）。

《中国药典》（2015版）四部 0682 制药用水中总有机碳测定法

三、系统适用性试验

要求：响应效率应为85％～115％。

试剂：

➜蔗糖标准溶液（含碳量0.500mg/L）

➜1，4-对苯醌标准溶液（含碳量0.500mg/L）

四、分析方法验证的要点

➤专属性（%碳）

➤线性度：5点

➤范围：嘴高和低之间的浓度覆盖域

➤准确度：（总有机碳）

➤精确度：%RSD百分标准偏差

➤低检测限（LOD）、低定量限（LOQ）

➤可靠性：在不同的使用条件

五、TOC方法验证的具体内容

➤专属性

专属性：专属性是能能非常准确地确定所存被测物质。ICH Q2（R1）如能对目标物质进行准确的定量检测，有机碳，就显示出这分析方法对有机碳具有专属性。这可通过检测具有代表性的一些有机——可选一些含有除碳、氢、氧以外元素的有机物，比如含有氯、硫、氮或磷的有机物

Example：FDA缺陷例子

“Your firm failed to establish and follow writtenprocedures to assure the cleaning and maintenance of equipment used in themanufacturing of drug products.  Forexample, cleaning validation for the CIP process vessel, which is utilized inthe aseptic formulation of the CIP process vessel, which is utilized in theaseptic formulation of trivalent bulk influenza vaccine… The study did notinclude swab sampling of the product transfer lines.”

贵司未能建立和遵循已写的操作规程，在药品制造中确保清洁和维护设备。例如，流感疫苗的CIP过程罐清洁验证未包括对生产线的棉签取样实验。

➤线性和范围

线性：是指测定结果与试样中被测物浓度呈正比关系的程度。

范围：是指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

➜定量检查应至少测试5个浓度范围并且包含清洁的低限和嘴高限度。

➜线性的相关系数应不低于0.98%。

➜浓度范围应达到残留物限度的50%-150%。

➜淋洗法和棉签法用于限度检查时不需做线性/范围验证。

Example：TOC测量值和目标物浓度的相关性

参考文献：《药物分析杂志》 2013.33.（3）

➤精密度和准确度

要显示TOC法的精密度和准确度，以含10-6碳的标准品溶液连续检测10次。这里选用此碳浓度来评估精密度和准确度是因为通常残留物的 TOC限度一般为此水平左右。在此 TOC水平，精密度为 1％，准确度为±5％。

➤回收率试验

确定合适取样方法（冲洗方法、擦拭方法、取样人员的操作培训及检测方法）可使污染物/残留被有效收回，终为验证方法提供证据。

通过回收率试验验证取样过程的回收率和重现性。

通常取样回收率和检验方法回收率结合进行。

Ø  取样方法

Ø  擦拭法回收率

可接受标准    回收率：≥50%

              重现性：≤20%

步骤举例：

1、准备1块500 mm ×500 mm的平整光洁的不锈钢板。

2、在钢板上用钢锥划出400 mm ×400 mm的区域每隔100 mm划线形成16块100 mm ×100mm的方块。

3、配制浓度为160 mg/L的妥布霉素水溶液定量装入喷雾器。

4、将约10 mL溶液尽量均匀地喷在400 mm ×400 mm的区域内。

5、根据实际喷出的溶液量计算单位面积上的妥布霉素量约1μg/100mm2。

6、自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板。

7、用注射用水润湿棉签按擦拭取样操作规程擦拭钢板每擦一个方块，100 cm2换一根棉签。在钢板上取均布的8个方块。

8、将棉签分别放入试管中定量加入注射用水10 mL，加塞轻摇试管并放置10 min，使物质溶出。然后将溶液稀释10倍。

9、使用TOC分析仪测定此清洁验证水样的TOC值。

北京钮因TOC

10、计算回收率。

擦拭回收率（%）=0.8914/1×100%=89.1%

         带入校正公式                           实际计算值

结论：理想的回收率，说明TOC分析方法适合目标化合物擦拭法的清洁验证检测。

Ø  擦拭技术

注意：连贯性，固定的力度、速度和线路。

Ø  淋洗法回收率

通常淋洗法限度检查不需做回收率验证，定量检查应做回收率验证。可以利用淋洗溶剂冲洗已知量（在限度附近）的分析物确定回收率，回收率通常应不低于95%。

淋洗法样品可以冲洗液直接检测，也可以冲洗液做稀释后检测，无论直接检测还是稀释检测都应在接到样品后首先将样品同空白溶剂做视觉检查确定是否有颜色差异和异物存在，如果有述现象发生，可直接判定样品不合格。

Ø  回收率接受程度

➤低检测限（LOD）、低定量限（LOQ）

LOD/LOQ推演法

记录低浓度纯属标样的实测TOC值和标准偏差（用250、500、750ppbTOC的蔗糖）

使用小二乘线性回归算法，确定标样的标准差比实测浓度的方程；确定Y轴为标准偏差，X轴为深度。

根据回归分析确定该行的Y轴截距

Y轴截距代表零分析物浓度时的标准伪善（Y轴截距＝│S0│）

计算检测限（LOD＝│Y轴截距│×3）

计算检测限（LOQ＝│Y轴截距│×10）

参考文献：Taylor,John K,Quality Assurance of Chemical Measurement(化学测量的质量保证)  Lewis Publishers imprint of CRC press(1987)

六、TOC分析方法的注意点

➜更好使用校准曲线，即TOC和目标物浓度的线性相关性是否良好。因为每一有机物的氧化效率是不同的。（除非氧化效率高，可以忽略）

➜擦拭法需要同时对照溶剂（如注射用水）和空白棉签，即擦拭空白coupons，进行TOC分析，来判定干扰程度。

➜必须选择原理、量程合适的TOC分析仪。因为清洁验证的水样与注射用水不同，无法预测水样的清洁程度。