细菌氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒
产品说明书

主要用途

YIJI细菌氢ATP酶（H＋-ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在排除其它ATP酶干扰的情况下，受到氢ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞H＋-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

氢ATP酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.14），又称为质子或氢离子转位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type）、真细菌型（eubacterial type）和囊泡型（vacuolar type）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的质膜上，约100kd蛋白；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部分组成；囊泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。氢ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内ATP释放的能量逆向跨质膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜两侧H的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。细菌氢ATP酶的重要性在于调节细胞内pH水平，是细菌细胞生存和存活的必要条件。基于ATP，在排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）等ATP酶的干扰下，受到氢ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析氢ATP酶的特异活性。其反应系统为：

产品内容

YIJI裂解液（Reagent A）                                   毫升    
YIJI保存液（Reagent B）                                     毫升
YIJI缓冲液（Reagent C）                                  毫升
YIJI酶促液（Reagent D）                                   微升
YIJI反应液（Reagent E）                                   毫升
YIJI底物液（Reagent F）                                      毫升
YIJI阴性液（Reagent G）                                       毫升
产品说明书                                                    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
恒温摇床：用于细菌培养
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光谱分析的容器
分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。
 
一、样品准备

1．准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM
2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升
3．置于冰槽里5分钟
4．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
5．小心抽去上清液
6．加入xx微升YIJI裂解液（Reagent A），充分混匀
7．转移到预冷的1.5毫升离心管
8．强力涡旋震荡15秒
9．置于冰槽里30分钟，期间强力涡旋震荡15秒三次
10．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
11．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
12．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心去掉上清液 
14．加入xx微升YIJI保存液（Reagent B），混匀
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1．准备好待测样品（例如纯化细菌细胞膜蛋白等），置于冰槽里 
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
3．YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1．移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
4．加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

四、样品活性测定

1．移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
4．加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入50微升待测样品（注意：50微克膜蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟
 
五、计算样品活性
 

注意事项

1．本产品为21次操作，包括背景对照测定
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  
5．加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
6．反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟
7．测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性
8．光谱测定后，比色皿须清洗*
9．建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒YJ30030.1）
10．样品特异活性是指排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性
11．氢ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列ATP酶类分析技术产品 
 
质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测准确

订购信息

单组分订购信息

编号                    名称                                                规格        
YJ50244.3            YIJI细菌氢ATP酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次        
YJ50244.3A            YIJI裂解液（Reagent A）                          100毫升
YJ50244.3B            YIJI保存液（Reagent B）                            50毫升
YJ50244.3C            YIJI缓冲液（Reagent C）                               100毫升
YJ50244.3D             YIJI酶促液（Reagent D）                                10毫升
YJ50244.3E             YIJI反应液（Reagent E）                                10毫升
YJ50244.3F             YIJI底物液（Reagent F）                                10毫升
YJ50244.3G            YIJI阴性液（Reagent G）                            10毫升
YJ30030.1            YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒                    200次

试剂盒订购信息

产品编号    名称    规格
YJ50244.1    动物细胞氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次
YJ50244.2    动物组织氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次
YJ50244.3    细菌氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次
YJ50244.4    酵母氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次
YJ50241.5    植物氢ATP酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒    20次