一、 摘要：

随着Car-T细胞治疗的发展，测试不同的Car-T细胞，并将代谢特征与表现良好且符合预期的Car-T细胞表型联系起来，使CAR构建和制造过程优化。

Vasoactive intestinal peptide（VIP）是一种新兴的T细胞功能的检查通路。

VIP在T细胞和肿瘤细胞中均有表达，并在TCR激活过程中大量表达。在原代人类T细胞的扩增过程中，VIP/VIPR轴的增强了分化程度较低的T细胞表型、抗肿瘤细胞毒性和体内持久性。

通过工程改造Car-T细胞分泌新的、有效的VIPR拮抗肽，这些细胞可以克服对富含VIP的肿瘤微环境的免疫抑制（图1）。拮抗T细胞中的VIP/VIPR轴可增强T细胞介导的抗肿瘤能力。

在项目的这一部分，我们研究通过培养基氨基酸分析来表征增强型Car-T细胞制造过程-将代谢特性与期望的、低分化和非耗竭型Car-T细胞族相关联。

二、 实验方法

为了研究VIPR拮抗剂是否影响代谢通路，我们使用快速培养基氨基酸维生素分析仪Rebel（908 Devices）进行了反应液分析，以确定CAR和CAR/VIPRa T细胞之间的氨基酸使用差异。培养基分析提供了在细胞胞外环境中化合物的消耗和积累的数据。

新鲜培养基和反应液分析显示了，丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸等氨基酸消耗的差异。这促使我们进一步研究这些Car-T细胞内代谢通路利用和代谢物改变的差异。利用LC/MS代谢组学和细胞生物能学来阐明CAR和CAR/VIPRa T细胞代谢状态之间的差异。

完整的研究包括以下描述步骤：

● 体内-Car-T细胞功能和效力，以及寿命

          ⅰ、荧光标记物肿瘤成像

● 显微镜法视觉评估细胞（数字形式、形状、表达生物标记）

          ⅰ、评估T细胞的肽分泌

● RNA测序

● 海马线粒体应激测试代谢呼吸状态和应激

● 抗原刺激

          ⅰ、试验激活（如抗原刺激细胞因子和激活试验）

          ⅱ、细胞毒性

          ⅲ、增殖

● 流式细胞仪-具有特异性标记物的细胞数量和比例

● Rebel-新鲜培养基和反应液的氨基酸分析

● 蛋白质结合分析-效力和活性测定，与抗原、抗体和底物等

三、 快速培养基氨基酸维生素分析仪Rebel：随时为您的生物过程调整提供参数指引

● 氨基酸、维生素和生物胺的快速分析

● 最小所需样品：低至10µL

● 简单样品准备：离心或过滤后稀释

● 集成式自动分析仪：自动进样器、分离、检测、分析和报告显示

● 分析运行时间：~10分钟每个样品

● 试剂盒耗材：200次分析

四、 结果

图3. A：用新鲜培养基（RPMI+10%胎牛血清）分析了细胞培养基中氨基酸的起始浓度。值得注意的是高浓度的精氨酸，而缺少丙氨酸。

图3.B和3.C：来自不同供体（3.B-样品29和3）（3.C-样品51）的反应液分析，显示在培养终点非常相似的AA浓度水平。值得注意的是，反应液中丙氨酸的产生/分泌和精氨酸的显著消耗，以及应激细胞和对照细胞样本之间的差异。

图3.D对含VIP受体拮抗肽结构的氨基酸的进一步分析显示，培养终点的丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸等氨基酸水平存在差异。

图4. A采用LCMS分析来研究细胞内代谢，通过测定细胞内代谢物的丰度来确定不同代谢通路（糖酵解、TCA、PPP、AMP/ATP）的利用。

图4.B线粒体应激实验通过功能测定抗原刺激和对照细胞的糖酵解和氧化磷酸化利用。

五、 总结

我们发现，当细胞受到抗原刺激时，CAR/VIPRa T细胞的能量明显增加。相比之下，Car-T细胞变得能量更少，糖酵解作用更多，这是T细胞衰竭的已知特征。此外，用多种方法进行的代谢评估产生了与此评估相关的结果，如耗氧量和反应液中的某些氨基酸水平。最后，Car-T细胞活性、效力和细胞毒性评估显示与抗肿瘤活性相关。总之，这项工作表明，不同的代谢特征证明CAR/VIPRa T细胞在抗原刺激时增强对肿瘤的作用。