徕卡冰冻切片机的技术操作

      徕卡冰冻超薄切片技术是使样品迅速冷冻，然后用冷冻切片机进行冷冻超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁杂的化学固定与包埋操作，在细胞化学研究中有着特殊的用途。为了很好保存形态结构，必须使游离水形成玻璃态的冰，防止产生冰晶。这就要求很高的冰冻速率(~度/秒），这对于传热性能差的生物材料来说是困难的。一般除了尽可能地提高冷冻速率外，还可考虑采用尽可能小的样品尺寸(小于1立方毫米)，对样品进行冷冻保护处理等，但通常也只能在样品表面几微米到几十微米范围内能达到玻璃态。更深层将会因冷冻速率低而产生冰晶损伤。

下面是徕卡冷冻超薄切片法的主要步骤。

一、包裹

1、在一聚乙烯塑料管中加入牛血清白蛋白，贴A溶于0.1ml的磷酸缓冲液中，pH7．2，浓度为10％一20％；

2、符经固定的组织块表面的残余液体月滤纸吸干，L一面振动塑料管，一面向其中逐滴加入25％的戊二醛，使管中戊二醛的zui终浓度为2．5％；

      L在上述条件下，徽约在半分钟左右即可被戊二醛交连(聚合)，用保险刀片将塑料管壁切除。把聚合的胁切成小方块，使其大小赂大于包埋于其中的组织块。如果样品是游离细胞，可按下进步骤包裹：

1、将帕A加入一离心管内，浓度与上同；

2、把经过固定的细胞转入离心管；

3、在冷冻离心机上离心10分钟，800B，40C；

4、去掉上清，在管底沉淀上加一滴用0．1m01／L磷酸缓冲液配制的10％的戊二醛。

5、用针把聚合后的团块拨起，切成小块。

      为防止冷冻时生成大的冰晶而使结构破坏，组织需经冷冻保护剂处理，常用的冷冻保护剂有甘油和蔗糖，均用缓冲液配制，组织在冷冻保护剂中浸泡的时间为0.5—1J。

     为防止大的冰品产生，徕卡冰冻切片机除使用冷冻保护剂外，应采取速冻的办法，其基本要求与具体作法和冷冻断裂与蚀刻时相同，即将经冷冻保护的组织块投入用液氮冷却的氟里员12内。

二、染色

      经过固定和甘油或DM肋保护的组织，其冷冻超薄切片可以使用酷酸铀和柠檬酸铅染色。如果冷冻保护剂使用的是蔗糖，上述染色将会使结构严重破坏。

      对于徕卡冰冻切片机冷冻超薄切片，zui常使用的染色方法是负染。这时，可较正染法看到更多的结构细节。负染的染液有钧酸铵(2％，PH7．3)，醋酸铀(0.5％，pH4．6)或酸性磷钨酸(1％，pH6.7)染色时间为15—30秒，室温。染后，用一湿的滤纸将多余染液吸

       以上所述的冷冻超薄切片制备法适用于形态，细胞化学或免疫标记研究。制备过程中样品要通过一系列的水溶性介质，可称为湿法。湿法会使样品中的可溶性成份流失，因此不能用于这些成份的研究。为研究绍胞中的可扩散的，水溶性成份，应当使用于法制备超薄切片。

       徕卡冰冻切片机冷冻干燥后的带有切片的载网的氮气，并用棉花塞盖紧。干切法得到的切片不能染色。常规电镜样品制备过程中，为保存细胞结构，样品首先需要用化学固定剂固定。即使在冷冻超薄切片法中，为稳定切片，样品也需经过固定。而任何化学固定剂都可能使生物大分子变性，从而存在着破坏细胞细微结构的潜在危险。为避免这种可能，是*不用化学方法而改用物理方法固定组织。冷冻置换就是这样一种方法。徕卡冰冻切片机的冷冻置换技术则是避免了化学固定的影响。

备注：徕卡冰冻切片机复型膜的分离与捞取的部分文章由北京中仪光科科技有限公司编辑整理上传。