细胞支原体污染的荧光检测方法

DNA萤光染色法

· 原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。 

· 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 
· 缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。 


步骤： 
· 取出培养之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液,用PBS洗涤三次。 
· 于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置5-10 min。 
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的封片剂，并以盖玻片覆盖之。 
· 以100x-400x萤光显微镜观察。观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。 
结果判读︰
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 
(A)Negative result 
萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。 

(Positive Result 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。