过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒说明书
时间：2020-02-26 阅读：2527
过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒说明书
紫外分光光度法
测定意义：
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理：
H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：100uL×3瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。
2、CAT检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二（100 uL）中加入20mL试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周；
3、测定前将CAT检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min。
4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL样本，混匀；室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2
CAT活性计算：
1、血清（浆）CAT活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=678×ΔA
2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=678×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T =1.356×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.035×10-3 L；ε：H2O2摩尔消光系数，4.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.035 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万。