线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书
时间：2020-03-19 阅读：1899
线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH 传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
测定原理
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成 NAD+，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂四：液体 25mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂五：液体 1mL×1 支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水，现配现用。工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；现配现用；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％ 或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1） 工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2） 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记
录340nm处初始吸光值A1和2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)
÷T=365×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷
T=0.73×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T： 反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)
÷T=730×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)
÷T=1.46×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d： 96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。