一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NO（Nitric Oxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中， 特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一

种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。

测定原理：

NO 在体内或水溶液中极易氧化生成 NO2— ，在酸性条件下，NO2— 与重氮盐磺酸胺生成重氮 化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在 550nm 处有特征吸收峰，测定其吸光值， 可以计算 NO 含量。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。 试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL× 1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。（用之前震荡溶解后使用）

试剂二：液体 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。(用之前 60℃加热震荡 15min)

样品处理：

1.    组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，

加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 15min ，取上清，置冰上待测。

2.    细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g ，4℃ , 离心 15min ，取上清置于冰上待测。

3.    体液和培养液等其它液态样品：直接测定。

测定步骤和操作表：

1 、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm。

2 、操作表

NO 含量计算：

a.   用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.016x -0.0103 ，R2= 0. 9986

1 、组织样品：

（1）按样本质量计算

NO 含量(μmoL/g  鲜重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反总÷（V 样÷V 样总×W） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反总÷（V 样×Cpr） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷Cpr

2 、细胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）× 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷细胞数量（万个）

3 、其他样品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反总÷V 样

= 125×  ( ΔA +0.0103）

V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体积，

1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

b.   用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.008x - 0.0103 ，R2= 0. 9986

1 、组织样品：

（1）按样本重量计算

NO 含量(μmoL/g  鲜重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反总÷（V 样÷V 样总×W） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反总÷（V 样×Cpr） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷ Cpr

2 、细胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）× 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷细胞数量（万个）

3 、 其他样品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反总÷V 样=250×  ( ΔA +0.0103）

V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

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