糖基化是一种常见的蛋白药物翻译后修饰（PTM），在抗体关键质量属性中起着重要作用【1】。生物制品中N-和O-糖基化的深度表征对于确保药物安全性和有效性至关重要【1】。当应用于糖肽时，传统的基于碰撞的MS/MS方法，如碰撞诱导解离（CID），会导致不稳定聚糖部分的丢失。因此，使用CID精确测定糖基化位点非常具有挑战性，尤其是对于没有共有序列的O-糖基化。与CID相比，电子活化解离（EAD）在糖肽分析方面具有优势，因为它能够保存片段中的聚糖结构。依那西普是一种二聚体融合蛋白，由两条肿瘤坏死因子受体（TNFR）-Fc链组成，每条链上有3个N-糖基化和13个O-糖基化位点，本文将详细阐述EAD在糖肽水平上分析O-糖基化信息，采用EAD DDA或MRM^HR方法来表征去乙酰化依那西普的复杂O-糖基化特征。【2-4】。

SCIEX基于糖基化深度表征方案的特点：

1.EAD 准确鉴定糖基化位点：不稳定聚糖可以保留在EAD碎裂片段中，可准确鉴定糖基化位点，并可靠区分O-糖肽的位置异构体。

2.高质量的灵敏度和MS/MS数据：ZenoTOF 7600系统的Zeno阱可将MS/MS碎片的灵敏度提高5-10倍，从而实现高质量的MS/MS灵敏度和谱图质量。

3.快速灵活：EAD可在数据依赖采集（DDA）或高分辨定量（MRM^HR）模式下运行，具有快速扫描速率（DDA模式下约20 Hz）和可调整电子动能（0-25eV）的能力。

4.强大的数据分析平台：Biologics Explorer软件为肽图和PTM分析提供了强大、直观的分析能力。

含1个O-糖的糖肽

图1显示了两种胰蛋白酶酶切的O-糖肽（L1-R19和T243-K268）的EAD谱图，它们含有一个核心聚糖结构（HexNAcHex）。两个肽段都含有3个潜在的O-糖基化位点（2个Thr和1个Ser），但只有一个位点被HexNAcHex修饰。如图2所示，EAD产生了质量优异的MS/MS碎片信息，具有几乎完整的c/y/z片段序列，可以对这两种O-糖肽的进行可靠鉴定和聚糖的准确定位。具体而言，基于c7/c9和y11/z12片段的m/z，肽段L1-R19（图1A）中的O-糖基化位点被确定为T8，而基于检测到非糖基化c2/y23片段和包含糖基化的c3/y24/z24片段，肽段T243-268（图1B）中的T245被HexNAcHex修饰。

图1. 单O-糖基化肽段L1-R19（A）和T243-K268（B）的EAD谱图（1eV）。两种胰蛋白酶切肽段含有多个可能的O-糖基化位点（Ser和Thr），其中一个被核心聚糖结构（HexNAcHex）修饰。优异的EAD MS/MS谱图允许O-糖在肽段L1-R19（A）中的T8处和肽段T243-K268（B）中的T245处可靠定位。

图2. 用6（A）或7（B）HexNAcHex修饰的O-糖肽S202-K238的EAD MS/MS谱图（7 eV）。O-糖肽S202-K308含有多达7个O-聚糖，使用EAD对含有6（A）或7（B）HexNAcHex的物种实现了O-糖的准确定位。请注意，图2A显示了含有6 HexHAcHex的两种位置异构体之一的EAD MS/MS谱图，两种异构体的区别见图3。

我们观察到糖肽S202-K238的两种位置异构体，其含有6个HexNAcHex部分。图3显示了特征EAD片段，即用于区分这两种异构体的双电荷c11、c12和c15。从两种异构体的EAD产生的c12的m/z差异（365 Da）表明，T213（序列中的T12）在异构体1中被O-糖基化（图3B），但在异构体2中没有（图3E）。两种异构体的c15的m/z相同的事实表明，S216（序列中的S16）在异构体2中被HexNAcHex修饰（图3F），但在异构体1中未被糖基化（图3C）。这些结果证明了EAD在正确区分位置异构体方面的能力，这对传统的基于碰撞的MS/MS方法（如CID）是无法完成的。

图3. 区分含6个HexNAcHex O-糖肽S202-K238的两种位置异构体的特征c离子。两种异构体（异构体1和异构体2）分别基于在相同m/z下检测c112+和c152+离子（A和D）和包含异构体1（B）和异构体3（E）的4个和3个 HexNAcHex的c122+片段来区分。c122+的m/z表明，序列中的T12在异构体1（B）中被HexNAcHex修饰，但在异构体2（E）中没有，其中基于c152+（F）的m/z信息，S15被糖基化。

总结

4. EAD方法可用于阐明蛋白药物治疗中的复杂糖基化谱图信息。