细胞培养技术意义及应用

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。细胞培养技术在整个生物技术产业的发展中起核心作用，现代的生物技术一般包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，这些技术的发展几乎都与细胞培养密切相关。

细胞培养技术的应用领域

01、基础研究

如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究

02、药物研究开发

如新药筛选、疫苗、基因工程药物，细胞工程药物，研究与开发，单克隆抗体制备等

03、疫苗生产

如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、多肽疫苗（肿瘤疫苗）等

04、基因工程药物生产

如EPO等，抗体药物、基因治疗药物生产

05、细胞工程药物生产

生物细胞内的一些生物活性多肽、生物活性物质，如蛋白质等，预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性

HEK293悬浮培养，力康设备解决方案为参考

今天，采用力康相关设备的解决方案作为参考，以“二氧化碳恒温振荡器中进行HEK293悬浮培养的实验流程”为例，小编为大家奉上一篇干货满满的细胞培养知识盛宴。

此类哺乳动物细胞在培养过程中，培养基成本较高、生长条件较为复杂、生长周期较长、对剪切力和培养环境较为敏感，是较为典型的高要求细胞培养案例。

细胞培养可分为动物细胞培养、植物细胞培养、微生物细胞培养，其中，最困难的是动物细胞培养。动物细胞培养所要求的体外培养环境及培养条件较高，因此，对实验室设备的要求也较高。

用于细胞培养的相关设备很多，比如：生物安全柜、超净工作台、高速冷冻离心机、医用低温保存箱、二氧化碳培养箱、二氧化碳恒温振荡器、生物反应器、超纯水系统等，这些设备的品质在某种程度上决定了细胞培养的效果。

实验流程（仅供参考）

一、细胞驯化

（1）直接驯化：大部分情况下，培养于原培养基中的细胞，可以直接适应目标培养基，只要按照日常传代方式（稀释）更换培养基即可。

1、原培养基中的细胞，直接稀释传代到目标培养基中，细胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

2、将细胞置于37℃，5%CO2，转速为110~175rpm的二氧化碳恒温振荡器中进行培养

3、4~6天后对细胞培养液进行稀释（或者离心800rpm，3~5min更换上清），保持稀释（或者离心）后细胞密度为0.3~0.4×106cells/ml

4、经过在100%的目标培养基中的几次传代培养，传代后4~6天细胞的密度可以达到2~3×106cells/ml，细胞活率＞90%。这说明细胞已经适应了目标培养基，之后进行细胞的传代培养时，细胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml左右

（2）渐进式驯化：注意：选用低代次，处于对数生长期的细胞进行驯化。

1、原培养基中复苏细胞并继续使用该培养基传代2~3次至细胞生长稳定，当细胞密度达到2~3×106cells/ml后进行传代，传代后细胞密度控制在0.5~0.6×106cells/ml，5~10%血清的传统培养基或原无血清培养基与目标培养基的比例为75:25

2、将细胞置于37℃，5%CO2，转速为110~175rpm的恒温摇床中进行培养

3、当细胞密度3~4天后达到3×106cells/ml且细胞活率>90%，传代时5~10%血清的传统培养基或原无血清培养基与目标培养基的比例为 50:50,细胞密度控制0.5~0.6×106cells/ml

注：如细胞生长慢，可离心上清，留20%培养基，加入80%的5~10%血清的传统培养基或原无血清培养基与目标培养基比例为75:25的混合培养基，继续培养；再下次传代时重复步骤③

4、重复步骤③逐步增加目标培养基所占的比例（5~10%血清的传统培养基或原无血清培养基与目标培养基的比例为25:75至10:90）直到100%的目标培养基

5、经过在100%的目标培养基中的几次传代培养，传代后3~4天细胞的密度可以达到2~3×106cells/ml，细胞活率＞90%，这说明细胞已经适应了目标培养基。之后进行细胞的传代培养时，细胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml，一般传代2~3次后再进行转染实验。注意：一般细胞驯化过程中，前三代细胞的状态可能不是很好，但一般从第四代状态会有改善

二、细胞复苏

1、迅速取出冻存的细胞，在37℃水浴条件下进行解冻（可以将离心管在水中轻轻晃动，时间控 制在60s以内）

2、轻轻地混匀细胞并将融化的细胞全部移至 15ml（或 50ml）无菌离心管中（用培养基冲洗几次冻存管），逐滴加入5~8ml预热到37℃的目标培养基

3、离心换液（800rpm，3~5min）去除全部上清，加入预热新鲜目标培养基重悬，转移至125ml摇瓶内（用培养基冲洗几次离心管），最终达到25~40ml，使得细胞密度达到0.4~0.6×106cells/ml

4、将细胞置于37℃，5%CO2，转速为110~175rpm的二氧化碳恒温振荡器中进行培养

5、2~3天后通过人工或仪器测定细胞的密度及活率，若细胞密度达到2.0×106cells/ml，活率达到85%以上则可进行传代培养

6、如果细胞密度低于1.0×106cells/ml，则建议对细胞进行离心（800rpm，5min），然后重悬于20~30ml的新鲜培养基中使得细胞密度为0.4~0.6×106cells/ml左右，并继续培养至细胞正常生长则可进行传代培养

三、细胞传代

1、取细胞培养样品，人工或仪器测定细胞密度以及活率

2、原培养基中的细胞，直接稀释传代到目标培养基中，细胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

3、恢复活力的标准：活率＞95%，细胞形态规则圆整，生长倍增时间正常

4、将细胞置于37℃，5%CO2，转速为110~175rpm的二氧化碳恒温振荡器中进行培养，2~3天传代一次

四、细胞转染

细胞转染在目标培养基中，采用商业化转染试剂（例如Gibco293Fectin™、ExpiFectamine™293、TransfectionKit）或PEI（线性化聚乙酰亚胺），可以实现对 HEK293 细胞的高效转染，具体操作可参考所购买转染试剂盒的说明书进行实验。

1、转染前一天按照2.0×106cells/ml密度接种，培养第二天细胞密度可至4.0×106cells/ml左右

2、培养第二天，细胞计数后，细胞活率＞95%，活细胞密度≥4.0×106cells/ml，可直接使用；若细胞密度低于4.0×106cells/ml，可通过离心（800rpm，3~5min）收集细胞，将细胞以 4.0×106cells/ml密度重悬于目标培养基中 注：如果后期进行≥6天的瞬转表达同时不添加补料和葡萄糖，建议瞬转时密度控制在 2.0~3.0×106cells/ml

3、按照优化后的瞬转工艺，以20ml体系单抗使用PEI转染为例，制备DNA和PEI混合液

①配制A、B液，涡旋混匀后室温静止5min

②A：20ug质粒+600ul（培养基或PBS）

③B：80ugPEI+600ul（培养基或PBS），进行0.22um抽滤

④将A液加入到B液中轻轻吹打混匀，室温静置15min

4、将混合液加入到培养液中，进行培养

5、大于6天的培养时间，建议在20小时后加≤5%补料（也可再额外加入＜5g/l葡萄糖）加入培养基，可进一步提高活细胞密度和蛋白表达量。如果条件允许，可以检测残糖，控制残糖浓度在3~6g/l，效果更佳

6、培养至活力低于60%，结束培养。此步骤可以直接转染质粒进行表达，也可得到腺病毒（lentivirus表达系统）再进行病毒感染表达蛋白

五、细胞感染

1、按一定比例混合病毒和293细胞，进行感染

2、将细胞放置在37℃温度，5%CO2浓度，转速为110~175rpm的二氧化碳恒温振荡器中进行培养

六、细胞冻存

1、冻存细胞时，要选择处于对数生长期同期细胞在90%以上的细胞活率，一般建议冻存密度为 5~10×106cells/ml

2、事先计算好冻存的细胞管数和所用的培养基的体积

3、制备细胞冻存液：90%目标培养基+10%DMSO混合液存放在4℃，一般为当天用当天制备

4、对细胞样品进行计数

5、以800rpm，3~5min的条件离心收集细胞，然后用冻存培养基（4℃）重悬细胞

6、取样计数，调整细胞密度，使得细胞密度为 5~10×106cells/ml，迅速分装细胞到无菌的冻存管中，一般2ml的冻存管加入1~1.5ml细胞悬液，贴好标签，密封

7、将细胞冻存管放到程序降温冻存盒（注意填充异丙醇，4℃预冷）中，置于-80℃冰箱（每分钟下降1℃），过夜存放后将细胞转入液氮罐中进行保存。（注意：降温一定需要梯度降温：可4℃1h、-20℃2~4h，-80℃过夜，最后放入液氮长期储存。）

细胞培养技术，力康实验室相关设备

Smart Plus 超纯水系统

在上述实验流程中，细胞培养基干粉调制制备、细胞驯化过程中细胞培养液的稀释、细胞转染过程中转染试剂的制备等步骤，均需使用纯水或超纯水，在实验过程中经常被忽略的蒸发盘、水库、水盘，用来维持培养环境中的湿度，如果使用的纯水或超纯水不达标或蒸发盘、水库、水盘长期没有清洗，水中的杂质可能会扩散到培养环境中，从而影响细胞培养的结果。所以，实验室纯水和超纯水系统的选择尤为重要。

力康Smart Plus超纯水系统为您的实验提供满足《GB/T 33087-2016 仪器分析用高纯水规格及试验方法》、《GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法》、《GB/T 11446电子级超纯水中国国家标准》等标准的纯水或超纯水，助力您的实验研究取得圆满成功。

高速冷冻离心机

在上述实验流程中，细胞驯化、复苏、转染、冻存、细胞培养液的离心，均需使用高速冷冻离心机。如果细胞培养实验的目的是产物表达，那么对温度敏感性的产物，例如在低温条件下才能保持活性的蛋白质，离心过程中必须使用冷冻离心机，从而保障在实验步骤中，维持产物的活性，获得良好的实验结果。

力康高速冷冻离心机，为您提供稳定的运行工况、智能升降温控制、智能转子识别技术、电子式平衡装置，可满足细胞培养的实验需求。其出色的产品功能为您节省宝贵的时间，保护您珍贵的实验样品，助您尽快获得研究成果。

医用低温保存箱

在上述实验流程中，在细胞冻存过程中，需使用医用低温保存箱，保存箱的稳定性较为重要，如果出现局部失温或温度异常，以及冻存操作不标准或系统故障，珍贵的细胞种子样本极有可能失活。

力康低温冷链产品涵盖2-8℃冷藏保存箱、-25℃低温保存箱、-40℃低温保存箱和-86℃低温保存箱，拥有多种容积规格可选，双机复叠制冷，智能触屏操作、可选双独立系统主机、多重报警系统、采用第二代VIP技术、采用*低噪音技术等特点，产品可用于保存病毒、细菌样本、疫苗、生物组织及器官特殊食品、药品、材料等，为您的实验室研究提供稳定、理想的储存环境。

力康集团深耕医疗器械和生命科学领域三十余年，专注于提供多样化、多场景的临床医疗和实验室整体解决方案，包括智慧数字一体化手术室、数字化麻醉重症、数字化实验室、数字化新生儿科、数字化康复中心、数字化医疗及实验室信息管理以及数字化远程医疗整体解决方案等。

未来，力康将继续为用户提供智能化、数字化、 人性化的实验室设备，满足现代实验室应用需求，提供各类解决方案和专业化服务。